病毒的鸡胚培养法

实验九病毒的鸡胚培养
一、目的
掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理
二、实验内容
1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鮮种蛋。

15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。

每2小时翻番一次。

2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。

于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。

3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。

每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。

至120h全部取出于4℃冰箱过夜。

4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。

5、HA效价测定：原理。

1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。

血凝试验按下表操作。

1 2 3 11 12
稀释倍数212223 (211)
1
振荡混匀15秒，37C感作10-20分钟。

三、实验报告内容
1、病毒鸡胚培养的注意事项。

2、鸡胚尿囊液NDV HA效价结果，原理，并用原理说明HA效
价测定结果含义与意义。

2。

病毒的培养方法哪几种病毒的培养方法是研究和了解病毒特性、生命周期以及对人类和生态系统的影响的重要手段。

通过培养病毒，科学家可以进一步研究病毒的基本特征、复制和传播机制，以及开发疫苗和药物。

本文将介绍几种常见的病毒培养方法。

一、细胞培养法细胞培养法是常见的病毒培养方法之一。

病毒在体内是依赖于宿主细胞才能生存和复制的，因此通过培养感染体细胞的方式，可以实现病毒的大规模培养。

这种方法需要选取合适的细胞系，如HeLa细胞、Vero细胞等，将病毒接种在细胞培养基中，让病毒感染细胞并进行复制。

通过观察细胞的形态学变化、病毒颗粒释放和细胞死亡等现象，可以判断病毒的感染情况和生命周期。

二、鸡胚培养法鸡胚培养法常用于培养禽类和一些昆虫病毒。

在鸡胚培养技术中，科学家会将病毒接种到受精鸡蛋的卵黄囊或坏死胚中，利用卵黄囊提供的营养和鸡胚的生长环境，促进病毒的复制和生产。

通过观察鸡胚的发育情况和病变症状，可以判断病毒感染的程度和效果。

三、动物模型法动物模型法常用于病毒研究的初期，用于检测病毒分离和扩增的能力。

科学家会选择合适的动物种类，如小鼠、大鼠、兔子或猴子等，将病毒接种到动物的体内。

通过观察动物是否出现病征、病毒在体内的分布和病理变化，判断病毒的毒性和致病能力。

然而，由于动物模型法具有伦理和实验条件限制，现在越来越多的科学家转向细胞培养法和分子生物学技术。

四、感染性核酸和蛋白质培养法感染性核酸和蛋白质培养法是一种近年来发展起来的新技术。

通过利用已经纯化的病毒核酸或蛋白质，将其与适当的宿主细胞或胚胎培养在一起，使其感染并继续生长。

这种方法可以绕过病毒的复制步骤，直接利用病毒的核酸或蛋白质进行培养，从而更快地得到病毒产物。

然而，由于该方法无法复制整个病毒生命周期，可能会影响病毒的完整性和活性。

总结起来，病毒的培养方法有细胞培养法、鸡胚培养法、动物模型法和感染性核酸和蛋白质培养法等。

不同的方法适用于不同类型的病毒和研究目的。

1.目的规范本中心分离和鉴定各型流感病毒的操作方法，确保结果准确、可靠和实验室生物安全。

2.依据标准《流行性感冒诊断标准》WS285-2008附录A<仅限A1，A2.1>,附录G《全国流感监测技术指南》附件1<一、四、五>3.适用范围适用于各型流感病毒的分离和鉴定4.实验室生物安全级别及个人防护对采集自属于感染流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-2实验室内进行，并遵循生物安全二级个人防护。

在特殊情况下（如新型流感病毒的分离培养工作等），应根据实际情况调整实验室生物安全级别及个人防护级别。

5.标本的采集、处理和储存5.1推荐采集的呼吸道标本种类及拭子的选择发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。

气管插管的病人也应收集气管吸取物。

标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃冰箱，并马上送至实验室。

标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。

不推荐棉拭子和木柄。

标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）。

5.2标本处理实验操作人员在处理流感样病例标本时必须在BSL-2实验室的生物安全柜中进行。

标本在实验室内/间转运时需有双层防护包装。

标本在离开生物安全柜前，应使用75%酒精或新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量2000mg/L）对容器表面进行消毒。

收到标本后，应尽快处理并进行分离，避免反复冻融。

按标本类型不同分别处理：鼻、咽拭子标本应将管内拭子在管壁反复挤压后，弃去拭子；鼻腔、气管吸取物标本应用干净灭菌的毛细吸管反复吹打，以便打碎粘液；鼻腔或咽部冲洗液标本应充分振荡标本管，将粘液打碎。

咽拭子在进行挤压时，动作要轻柔勿剧烈操作，以防止产生气溶胶和液体溅出。

处理前将合适尺寸的纱布在新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量1000mg/L）中浸泡并拧干，平铺于生物安全柜内操作区。

一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。

2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。

3. 学习病毒分离和培养的基本原理。

二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。

病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。

本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。

三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。

2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。

3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。

四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。

2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。

3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。

4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。

5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。

五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。

2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。

3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。

六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。

2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。

3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。

七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。

2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。

3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。

八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。

病毒的鸡胚接种教学目标使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。

材料准备1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。

2.种毒新城疫病毒悬液。

3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。

4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。

方法步骤（一）鸡卵的保存、孵育及检卵1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。

2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。

将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。

3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。

鸡胚的生长情况分为以下几类：（1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。

（2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。

（3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。

（4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。

（二）各种途径的鸡胚接种方法1.尿囊腔接种（1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。

在气室中心或远离胚胎侧气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。

以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化（实图6-21）。

孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。

弃去接种后24 h内死亡的鸡胚。

实图6-20鸡胚的结构实图6-21尿囊腔接种（2）收获方法收获时间须视病毒的种类而定。

新城疫病毒在接种后24～48 h 即可收获病毒。

鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。

鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。

根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。

本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。

鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。

二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。

特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。

将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。

受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。

在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。

若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。

也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。

如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。

2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。

死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。

3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。

鸡胚培养病毒的鸡胚培养, 提纯, 鉴定1. 鸡胚的选择和孵化选SPF鸡胚, ⼊孵前0.1%新洁尔灭消毒表⾯. 在温度37.5-38℃, 湿度40%-57%通风良好的条件下孵育. 孵育过程中每天翻蛋两次, 要求蛋的⾓度要达到前俯后仰45°.在孵育的第五天照蛋, 去除⽆精蛋和死胚蛋, 第九⽇起每天照蛋2次, 去除死胚蛋.2. 病毒的接种病毒的浓度, 由病毒原始浓度, 将其稀释⾄效价为1:1280备⽤, 接种鸡胚时将其稀释1000倍,接种: 采⽤第9-10⽇龄的鸡胚, 进⾏尿囊腔接种, 接种量0.1ml,接种步骤: a 照蛋标出⽓室和⼤⾎管位置b ⽓室底边胚胎附近⽆⼤⾎管处标记注射位置c ⽓室向上放置于卵架上, 碘酒酒精消毒蛋壳d 注射点和⽓室顶分别队蛋壳打洞,e 1ml针头以30度夹⾓刺⼊3-5mm, 注射病毒液f ⽯蜡封⼝孵育: ⽓室向上, 孵箱温度36℃,湿度40%-57%, 定时换⽓, 捡出24⼩时内死亡的鸡胚, 培养48⼩时, 搜集24⼩时以后死亡的鸡胚,收获: 48⼩时后, 4℃冰箱过夜/-20℃ 1⼩时,避免收获时流⾎.⽓室端卵壳表⾯消毒, 镊⼦击破卵壳, 除去壳膜, 撕破绒⽑尿囊膜, 吸出尿囊液和⽺⽔, ⽆菌容器4℃保存待⽤. 同时可以取出鸡胚, 观察有⽆出⾎, 卷曲等病毒的提纯、分装及保存尿囊液经低速离⼼（2800r/min，800g）30min，弃去沉渣，含NDV的上清液再经低温超速离⼼（4℃，30000r/min，90000g）60min沉淀病毒。

沉淀物⽤pH7.2、0.01mol/L PBS重悬，并⽤0.5%新鲜鸡红细胞悬液测定NDV的⾎凝单位（Hu），然后稀释成1:1280Hu/ml，分装于安瓿，置-20℃保存备⽤，临⽤前解冻病毒的鉴定:(1)⾎凝实验(HA):试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10稀释倍数1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 对照⽣理盐⽔(ml) 0.40 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 病毒液(ml) 0.10 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25⽣理盐⽔(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25得最好稀释倍数, 称为病毒得⾎凝滴度.(2)毒⼒测定将BSR T7/5细胞培养于九孔板, 对数⽣长期, 24⼩时前换培养液, 将所得到的病毒液倍⽐稀释(按上表), 分别感染BSR T7/5细胞培养⽫,(⼩时后)观察细胞病变情况,计数噬菌斑, 将其与病毒浓度做图, 取呈线性关系的浓度段, 判断病毒的侵染⼒所需材料:1.SPF鸡蛋2.1%鸡⾎红细胞悬液3.0.1%新洁尔灭溶液4.病毒原液5.⽯蜡6.照蛋器7.卵架8.1ml注射器9.孵箱10.4℃冰箱11.⽆菌容器12.碘酒, 酒精, 镊⼦, 剪⼑, 洗管, (打孔器)附:1.病毒⾎球凝集单位: 能使鸡红细胞凝集的最⾼稀释倍数的病毒液0.25ml称为⼀个病毒⾎球凝集单位2.病毒的效价: 每单位体积中侵染单位的数量, 如寄⽣某寄主所需最⼩量病毒是0.1ml稀释⾄1/106的病毒悬液, 其效价为:1/(10-1X10-6)= 107.3.噬菌斑形成单位(pfu): 如0.1ml病毒悬液再单层细胞上形成20个蚀斑, 则每毫升病毒悬液的pfu是(1/0.1)X20=200pfu/ml4.鸡胚的判断: 正常胚胎: 可见有清晰得⾎管⼩团, 有鸡胚迹象, 可见有胚胎主动活动⽆精卵, 经过4天孵育后未见有胚胎迹象,仅见模糊卵黄影死胚或濒死卵: 胚胎运动呆滞或不动, ⾎管昏暗, 折断或飘落。

鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法，其基本步骤如下：1. 选择合适的鸡胚：通常选择9-12 日龄的鸡胚，此时鸡胚的免疫系统尚未完全发育，适合病毒的生长和繁殖。

2. 准备接种材料：将待接种的病毒样品稀释到适当的浓度，并准备好接种工具，如吸管、针头、注射器等。

3. 接种鸡胚：将稀释后的病毒样品接种到鸡胚的尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等部位。

接种时要注意操作规范，避免污染和损伤鸡胚。

4. 孵化鸡胚：将接种后的鸡胚放入孵化箱中，在适当的温度和湿度条件下孵化，让病毒在鸡胚中生长和繁殖。

5. 观察和检测：在孵化过程中，定期观察鸡胚的生长情况和病变特征，如鸡胚是否死亡、是否出现出血点、是否出现痘斑等。

同时，可以进行病毒的分离和鉴定，以确定病毒的种类和特性。

6. 收获病毒：当病毒在鸡胚中生长和繁殖到一定程度时，可以收获病毒。

收获病毒的方法包括离心、过滤、沉淀等，具体方法取决于病毒的种类和特性。

7. 保存病毒：收获的病毒可以保存在适当的温度和湿度条件下，以备后续的实验和研究使用。

需要注意的是，鸡胚接种是一项技术性较强的操作，需要严格遵守实验操作规范和安全注意事项，以确保实验的准确性和安全性。

同
时，在进行鸡胚接种实验时，应该遵循相关的法律法规和伦理规范，确保实验的合法性和道德性。

实验三动物病毒的鸡胚培养一、实验目的掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用三、器材1．病毒痘苗病毒〔Vaccinia virus〕，鸡新城疫病毒〔Newcastle distase virus〕。

2仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，25％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡〔固体石蜡加1／4凡士林，溶化〕，灭菌培养板，灭菌盖玻片等。

3白壳受精卵〔自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好〕。

四、操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育〔37℃，相对湿度是45%~60%〕，孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。

孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。

活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比拟大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。

生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。

鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d 后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供给缺乏，会导致鸡胚大量死亡。

2接种〔1〕绒毛尿囊膜接种℃将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。

℃用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形〔每边约5~6mm〕的小窗，不可弄破下面的壳膜。

在气室顶端钻一小孔。

℃用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜别离。

℃用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室〔图℃—4〕。

℃用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴005~痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。