菌种分离技术及其降低污染率与死亡率实验教改初探_任桂梅

第1卷 第7期环境工程学报V o l .1,N o.72007年7月Ch i n ese Jour nal of Env iron m enta lEng ineeri n gJ u l.2007用于青霉素废水处理的高效菌株的分离及特性研究韩 磊 纪树兰*任海燕 张国俊(北京工业大学环境与能源工程学院,北京100022)摘 要 从某制药厂污水处理站的活性污泥中筛选出两株能以青霉素废水中有机物为惟一碳源和能源的高效降解菌k1和k2。

通过形态及生理生化特征分析,初步鉴定2株菌为芽孢菌,其中k2为短小芽孢杆菌(bacillus pu m ilus )。

2株菌的最适p H 值分别为8和7,温度均为35 ,当废水含量50%时,菌株k1和k2对青霉素废水的COD 去除率分别为79%和81%。

单菌株与混合菌株对废水的降解特性试验表明,前48h 混菌对废水的去除率不及单菌株,而48h 后混合菌株去除率高于单菌株,60h 时达到最高为85%。

关键词 青霉素废水 高效降解菌 芽孢菌中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1673 9108(2007)07 0051 04Study on isol ati on and characteristics of high efficiency degradi ng bacteri u mfor penicilli n wastewater treat m entH an Lei Ji Shu lan Ren H aiyan Zhang Guo j u n(College ofE nvironm ent and En ergy Eng i neeri ng ,Beiji ng Un i versity ofT echnology ,B eiji ng 100022)Abst ract Two h igh efficiently deg rading bacteri u m strains(k1,k2)wh ich cou ld gro w on the orgn ic substrates o f penic illin w aste w ater as so le carbon and energy sources w ere iso lated fro m the sludge o f phar m acy w aste w ater treat m ent plan.t Based on t h e analysis o fm o r pholog ical and physio b i o che m ica l characteristics ,the t w o strains w ere iden tifi e d as bacillus ,k2w as bacillus pum ilus .The opti m a l p H for k1and k2w as 8and 7,re specti v e l y ,The opti m al te m perature w as 35 for both of the m.W hen the content of w aste w ater w as 50%,the deg radati o n rate o f C OD cou l d reach 79%and 80%respecti v e l y w ithin 36h.Experi m en tal resu lts sho w ed that t h e m i x t u re o f the t w o strains caused lo w er deg radati o n ra te w ithin 48h .But the degradati o n rate o f COD by the m ixed stra i n s w as higher than the si n gle strain after 48h,w hich cou l d riched 85%w ith i n 60h 。

较高温度对灵芝培养特性及灵芝酸产量的影响刘月芹;贺晓龙;任桂梅【摘要】灵芝具有重要的药用价值,培养条件的优化可提高灵芝中各种活性成分的含量.探讨了较高温度对灵芝发酵过程中的生理指标及灵芝酸产量的影响.结果表明,较高的发酵温度虽然降低了灵芝生物量,但提高了淀粉酶﹑漆酶﹑纤维素酶的酶活.发酵第4天,36℃培养条件下淀粉酶酶活达到最大值,比30℃发酵条件下的酶活提高了22.61％.发酵第10天,34℃培养条件下的漆酶酶活﹑纤维素酶酶活﹑可溶性糖含量和灵芝酸产量都达到最大值,相对于30℃的培养条件,分别提高了51.12％、30.41％、13.21％和45.23％.结果表明较高温度发酵有利于酶活和灵芝酸含量的提高,该研究为灵芝的高温发酵提供了新的思路和理论指导.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2019(039)002【总页数】7页(P90-96)【关键词】温度;灵芝;酶活;可溶性糖;灵芝酸【作者】刘月芹;贺晓龙;任桂梅【作者单位】延安大学生命科学学院,陕西延安 716000;延安大学生命科学学院,陕西延安 716000;延安大学生命科学学院,陕西延安 716000【正文语种】中文【中图分类】Q939.96;S567.3+1灵芝(Ganoderma lucidum)别名赤芝、灵芝草、仙草、红芝、神芝、丹芝、瑞草、神草、万年蕈，俗称木灵芝。

属于担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)灵芝属(Ganoderma)，是热带、亚热带地区生长发育的高温型菌类，在我国东北、华北以南地区均有分布。

灵芝具有较高的营养、保健和医疗价值[1]，是中国传统药用真菌，广泛应用于人类各种疾病的预防和治疗。

灵芝含有三萜类化合物、灵芝多糖、有机锗、硒、核苷酸、甾醇类、氨碱类、多肽类等160多种药用活性成分。

灵芝酸是灵芝三萜类化合物，具有保肝、抗肿瘤、抗 HIV-1 及 HIV-1 蛋白酶活性、抑制组胺释放、抑制胆固醇合成、镇痛、抑制血小板聚集、抗氧化等作用[2-4]。

黑龙江农业科学2023(12):55-63H e i l o n g j i a n g A gr i c u l t u r a l S c i e n c e s h t t p ://h l j n y k x .h a a s e p.c n D O I :10.11942/j.i s s n 1002-2767.2023.12.0055孟祥海,王佰成,张星哲,等.食用菌菌渣高效降解菌的筛选及主菌株产酶环境优化[J ].黑龙江农业科学,2023(12):55-63.食用菌菌渣高效降解菌的筛选及主菌株产酶环境优化孟祥海1,王佰成1,张星哲1,杨 冰1,李玉梅2,王延锋1,王金贺1,王希明3(1.黑龙江省农业科学院牡丹江分院,黑龙江牡丹江157000;2.黑龙江省黑土保护利用研究院,黑龙江哈尔滨150086;3.东宁市农业技术推广中心,黑龙江牡丹江157299)摘要:为筛选出高效降解食用菌废弃菌渣的复合菌系,有效促进菌渣的降解速率,明确复合菌系主要功能菌株最佳发酵环境㊂利用富集培养㊁限性继代培养和低温逐代驯化技术对205份采集的菌源材料进行筛选,通过对纤维素酶活性的测定,选取最佳菌源提取物料㊂同时采用划线分离培养,分离主要功能菌株,对菌株的产酶条件进行优化㊂结果表明,从205份菌源提取物质中分离纯化的1个具有较强的纤维素降解能力的材料,发现该菌属于曲霉属,产酶较高的主菌株是聚多曲霉(A s p e r g i l l u s s yd o w i i ),对该菌株的产酶环境优化发现,产半纤维素酶和纤维素酶的最优环境是菌渣35g ㊃L -1㊁硫酸铵3.5g ㊃L -1㊁吐温-80为1.4m L ㊃L -1㊁K H 2P O 41.0g ㊃L -1㊁M g S O 4㊃7H 2O1.0g ㊃L -1㊁N a C l 0.5g ㊃L -1㊁F e S O 4㊃7H 2O0.1g ㊃L -1,培养时间为15d ㊂最终明确了复合菌系中主要功能菌株的菌株类别及其发酵环境,可为废弃菌渣资源的快速降解提供宝贵资源,并为菌渣资源肥向利用提供技术依据㊂关键词:食用菌;废弃菌渣;纤维素降解菌;筛选;产酶条件收稿日期:2023-08-12基金项目:黑龙江省自然基金项目(L H 2020C 094);黑龙江省重点研发计划(G A 21B 002);国家农业微生物伊春观测实验站;国家农业科学牡丹江观测实验站;黑龙江省农业科技创新跨越工程(C X 23G G 08)㊂第一作者:孟祥海(1985-),男,硕士,助理研究员,从事土壤肥料研究㊂E -m a i l :m e n g x i a n gh a i 538@163.c o m ㊂通信作者:张星哲(1967-),男,博士,副研究员,从事植物保护研究㊂E -m a i l :jx n c z x z @163.c o m ㊂ 菌渣是指含有大量纤维素物质,也含有丰富的菌体蛋白和多种酶等活性物质的食用菌产业末端产生的废弃物质㊂中国是全球最大的食用菌生产国,自2013年以来产量已突破3000万t,占全球总产量的70%以上[1]㊂2021年黑龙江省食用菌业规模稳定在67.6亿袋,其中木耳菌渣占64.37亿袋,总产量(鲜品)达到338万t ,废弃菌渣总产量达到270.4万t [2]㊂在食用菌产业快速发展的同时,生产出食用菌后的栽培废弃物总量也呈逐年上升趋势㊂国内多数菌渣被作为生物质燃料焚烧发电,随着国家双碳政策及黑土地保护政策的提出,菌渣作为一种优质有机肥源被重视㊂目前利用废弃菌渣的途径主要是将其发酵制成有机肥料[3-7],因菌渣结构的纤维素晶体性导致难以降解,从而导致有机物利用率较低,且国内外对菌渣有机肥料的研究大多集中在传统堆肥发酵水平,堆肥时间长㊁费时费力㊁耗财,菌渣的腐解率一直没有得到很好的提高[8-10],因此,废弃菌渣的高效降解问题一直是制约菌渣肥向利用的主要因素[4],而高效降解菌渣离不开纤维素降解菌的筛选㊂目前有关纤维素降解菌的报道较多,但研究大多集中在秸秆降解方面,对废弃菌渣降解的报道较少,刘晓梅等[11]从不同地点堆放的杏鲍菇菌渣中采集样品,筛选到4株具有高效纤维素降解能力的细菌,经过制备复合菌剂发现在菌渣堆肥过程中促腐效果较好㊂葛江丽等[12]从土壤㊁腐殖质和牲畜粪便中筛选出能够高效降解菌糠纤维素的菌株N 3,并优化了其发酵条件㊂黑龙江省近几年主推以生物技术解决乡村振兴路上废弃菌渣利用率低和缺乏轻简化处理手段等问题,故本研究于黑龙江省不同地点采集菌源提取物质205种,进行室内微生物培养试验,筛选出废弃的菌渣高效降解复合菌系,经滤纸条降解实验和纤维素酶活力测定,并对主要成分菌株进行分类鉴定,明确其最佳的产酶条件,为菌渣资源的利用提供技术依据㊂进而挖掘产酶量高的优等菌株,改变以往人工培养复合菌群在天然木质纤维素分解过程中区域适应性差的问题[13]㊂55黑 龙 江 农 业 科 学12期1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌源提取物采集 2018年10月至2020年5月,在黑龙江省年均气温-7~10ħ的区域内,采集包括菌渣(木耳菌渣㊁大球盖菇菌渣等)㊁发酵堆肥菌渣㊁作物腐烂秸秆(玉米秸秆㊁水稻秸秆㊁烂杂草等)㊁耕层及剖面土壤(暗棕壤㊁草甸土㊁树林土㊁秸秆还田土㊁菜园土㊁常规耕地土等)㊁粪肥堆(牛㊁羊㊁猪粪等)㊁牛羊胃瘤残留物等有机肥源腐熟物质在内的205种菌源㊂1.1.2 碳源材料 以检测滤纸W h a t m a n N o .1和黑龙江省农业科学院牡丹江分院食用菌研究中心的食用菌菌渣作为培养基中的碳源,洗净烘干后备用㊂1.1.3 培养基 富集培养液:胰蛋白胨5.0g ,酵母浸粉1.0g ,N a C l 5g ,蒸馏水1L ㊂继代培养基:(N H 4)2S O 42.0g ,K 2H P O 41.0g ,M g S O 4㊃7H 2O 0.05g ,C a C O 32.0g ,N a C l 0.2g ,土壤浸出液10m L ,蒸馏水1L ㊂产酶培养基:C M C -N a 10.0g ,蛋白胨10.0g ,N a C l 10.0g ,酵母素5.0g ,p H 自然;菌渣培养基:蛋白3.0g ,(NH 4)2S O 46.0g ,尿素3.0g ,C a C l 20.1g ,M g S O 4㊃7H 2O5.0g ,K 2H P O 41.0g ,N a C l 0.1g ,F e S O 4㊃7H 2O0.05g ,M n S O 4㊃7H 2O0.016g ,Z n S O 4㊃7H 2O0.014g ,C a C l 20.02g ,蒸馏水1L[11]㊂分离培养基:①赫奇逊C M C 培养基(A ,g㊃L -1);②赫奇逊C M C -N a 培养基(B ,g ㊃L -1);③纤维素刚果红平板培养基(C ,g ㊃L -1);④纤维素刚果红平板培养基(D ,g ㊃L -1),4种培养基具体配方参考文献[14]㊂筛选培养基:①D u b o s 纤维素培养基(E ,g㊃L -1):K 2H P O 41.0g ,N a N O 30.5g ,K C l 0.5g ,C M C 5.0g ,M g S O 4㊃7H 2O 0.5g ,F e 2(S O 4)3㊃7H 2O 0.001g ,p H 7.5;②蛋白胨纤维素培养基(F ,g㊃L -1):C a C O 32.0g ,K 2H P O 40.5g ,N a C l 5.0g ,M g S O 40.5g ,蛋白胨5.0g ,纤维素5.0g ,刚果红0.1g ,酵母膏5.0g ,微量元素溶液0.5m L ,50ħ静置培养[15]㊂1.2 试验设计1.2.1 复合菌系的筛选 富集培养液:取编号为5g 的菌源样品接种到装有富集培养基的灭菌三角瓶中,50r ㊃m i n -1震荡30m i n 后静置,于28ħ培养,每天观察培养物情况,培养20~30d 至富集培养基颜色变深,滤条断裂分解,菌渣溃烂时,取培养液10%的接种量接种到上述新鲜富集培养基中继续富集培养,如此反复5次转接,完成富集培养㊂继代培养:取富集培养后的培养液,在25ħ条件下,以菌渣和W h a t m a n N o .1滤纸为唯一碳源的继代培养基中,按10%的接种量或1c mˑ1c m 小块固体平板琼脂样品(捣碎)接种,培养到滤纸条黄化断裂并记录黄化断裂时间,如此5次转接㊂低温驯养:从第6代继育开始,每隔1代培养温度降低1ħ,当培养温度降至15ħ后,每隔2代再降1ħ,直到降至8ħ㊂对分解能力减弱的样品,在限制继代培养的低温驯化中予以淘汰㊂初筛:在产酶培养基和菌渣培养基中接种经限制性继代培养和低温驯化培养仍保持良好分解能力的培养物,测定纤维素酶活性和菌渣降解率㊂复筛:测定菌渣木质纤维素的降解率及对其他纤维素物质(滤纸㊁脱脂棉)的降解能力,将初筛所得的复合菌系以5%的接种量接入菌渣培养基,在15ħ条件下恒温培养㊂1.2.2 分离复合菌系纤维素降解菌 吸收复合菌系培养液1m L ,按10倍法稀释至10-6,取10-6稀释液0.1m L 涂布于分离培养基A ㊁B ㊁C ㊁D 中,每次处理3次重复,28ħ培养72~96h ,计算菌落数量㊂根据菌落的形态㊁色泽等对单菌落进行挑拣,经提纯处理后按常规方法进行保存[16]㊂1.2.3 滤纸分解效果鉴定(菌株初筛) 采用滤纸分解法,将滤纸剪成小条,放入试管内,使其略呈液面外露,并将滤纸剪成小条,使滤纸在试管内露出液面㊂以滤纸为唯一碳源的培养基E (杜博斯液态培养基)接种各菌株,再振荡培养5d ,30ħ110r ㊃m i n -1,观察滤纸崩解作用;F P A 酶(3,5-二硝基水杨酸比色法测定)是在初筛的基础上,针对6512期孟祥海等:食用菌菌渣高效降解菌的筛选及主菌株产酶环境优化崩解效果较好的菌株进行测定,为评价指标进一步筛选,得到纤维素功能降解菌株[17]㊂1.2.4培养基筛选(复筛)将筛选得到的功能菌株分别接种到菌株筛选培养基E和F中,进行功能培养基的筛选,每处理3次重复,同时测定F P A酶活性,确定最佳菌株㊂1.2.5菌株鉴定分子生物学鉴定筛选出的纤维素降解菌株:真菌透过I T S r D N A进行分子特征辨识,并提取真菌基因组D N A,利用一般引引物I T S1㊁I T S4R扩增P C R㊂细菌主要通过16Sr D N A进行分子特征鉴定,用细菌D N A提取试剂盒提取细菌基因组D N A,用通用引物27F和1492R扩增P C R㊂扩增产物送至北京美优安诺生物科技有限公司测序,获得的D N A序列提交至N C B I数据库,利用M E G A构建系统发育树[16-18],通过B L A S T序列比对[18-19]㊂1.2.6菌株产酶条件优化每个菌种试管内加入适量无菌水,强烈振荡制成等浓度的菌悬液或孢子悬液㊂取等量不同菌种的菌悬液孢子悬液,混合均匀即成发酵用的种子液㊂本试验设置4个变量分别为菌渣㊁硫酸铵㊁时间和吐温-80,采用均匀设计U7(74),每个变量设置7个水平,总计7个处理,每处理5次重复(表1)㊂表1试验设计处理菌渣x1/(g㊃L-1)硫酸铵x2/(g㊃L-1)时间x3/d吐温-80x4/(m L㊃L-1)T152.590.2T2101.0131.2T3152.031.0T4203.5150.6T5250.550.4T6303.071.4T7351.5110.8于基础底液(K H2P O41.0g㊃L-1㊁M g S O4㊃7H2O1.0g㊃L-1㊁N a C l0.5g㊃L-1㊁F e S O4㊃7H2O 0.1g㊃L-1)中加入相应的硫酸铵和吐温-80充分振荡,取100m L分装于三角瓶中,加入对应的菌渣量,经121ħ灭菌30m i n并冷却,加入5m L种子液,在恒温水浴振荡器(120r㊃m i n-1,28ħ)中按表1的时间培养㊂1.3测定项目及方法1.3.1粗酶液的制备培养后的发酵液经4ħ㊁3000r㊃m i n-1离心15m i n后的上清液即为粗酶液[20]㊂1.3.2纤维素酶活力的测定主要测定滤纸酶活性(F P A)㊁羧甲基纤维素酶活性C M C㊁C1酶活性㊁β-葡萄糖苷酶活性等4个纤维素酶活性㊂C M C酶活测定按照国际理论与应用化学协会(I U P A C)推荐国际标准方法[21]㊂用50m g脱脂棉代替滤条,其余步骤参照F P A的测定方法测定外切-1,4-P-葡聚糖酶活性(C1酶活)㊂滤纸酶活性(F P A)测定方法:取4支25m L试管,在测定管中加入0.2m L酶液和1.8m L的柠檬酸钠缓冲液(p H4.8),在空白管中加入1.8m L 的柠檬酸钠缓冲液高温灭活㊂将1c mˑ6c m滤条加入上述试管中,充分浸泡后同时放置50ħ恒温水浴60m i n;再加入D N S显色液3m L,沸水浴10m i n,冷却后移到容量为25m L的容量瓶中,加入蒸馏水至刻度㊂空白调整为零,测540n m 处O D值,如此反复进行4次㊂β-葡萄糖苷酶活性测定方法:取4支试管,将2m L酶液和1.8m L水杨苷(质量分数0.5%)加入测定管,在空白管中加入0.2m L酶液,经高温灭活后加入p H4.8的柠檬酸钠缓冲液1.8m L㊂经50ħ恒温水浴30m i n后,加入D N S显色液3m L,经沸水浴10m i n冷却后移至25m L容量瓶中,加蒸馏水至刻度㊂空白调零,540n m测O D 值,重复4次[22]㊂在上述条件下,定义每分钟催化纤维素水解生成1μm o l葡萄糖的酶量为酶活力单位,以国际单位为基础㊂酶活力(U㊃m L-1)=葡萄糖含量(m g)ˑ稀释倍数ˑ5.56反应液中酶液加入量(m L)ˑ时间(m i n)[23] 1.4数据分析试验结果用平均值ʃ标准差表示㊂回归方程建立采用最优多元线性分析(S P S S19.0),根据方程优化产酶条件㊂产酶条件的验证采用t检验㊂2结果与分析2.1菌渣高效降解复合菌的筛选对205份菌源提取材料,采用富集培养㊁限制性继代培养㊁低温驯化培养等技术进行初筛,经过75黑 龙 江 农 业 科 学12期5次重复转接,富集培养获得具有纤维素分解能力的培养物,可使43份材料发生崩解㊁断裂的滤纸条和腐烂的菌渣丝状化;经过10次的继代培养,富集后表现较好的培养物通过测定43个菌源提取材料的降解率,初步筛选出25个具有较强的菌渣降解率的样品㊂其中降解率在50%以上的有1份材料㊁降解率在40%以上的有1份材料㊁降解率在30%以上的有4份材料㊁降解率在20%以上的有10份材料㊁降解率在10%以上的有8份材料㊁降解率在10%以下的有1份材料㊂经低温驯化培养得到可在15ħ条件下分解纤维素物质的菌系17份,通过不同代数菌渣降解率及纤维素酶活性测定,获得一株可在低温(12ħ)条件下可以分解菌渣且纤维素酶活较高的复合菌系M D J 39㊂2.2 M D J 39复合菌系纤维素降解菌株的分离与鉴定由表2可知,以培养基D 分离效果最好,平均分离菌落数为39.4C F U ㊃g -1,显著优于其他3种分离培养基㊂表2 不同培养基纤维素降解菌株分离效果样品分离菌落数/(C F U ㊃g-1)培养基A培养基B培养基C培养基D 13854211230322010043236052113均值2.22.82.239.4由表3可知,从M D J 39中共获得了33个菌株,其中降解能力较强的菌株11个,有中度降解能力的菌株4个,有轻微降解能力菌株9个,没有任何降解能力的菌株9个㊂通过测定F P A 酶活性,从11个菌株中进一步筛选纤维素降解功能菌㊂结果表明:M D J 39-33的F P A 酶活性最好,为21.55U ㊃m L -1,显著好于其他菌株,被确定为纤维素降解菌株(表4)㊂同时,比较发现M D J 39-33㊁M D J 39-31㊁M D J 39-23㊁M D J 39-21㊁M D J 39-13功能菌株在蛋白胨纤维素培养基上F P A 酶活性较高(表5),其中M D J 39-33F P A 酶活性最高,为41.55U ㊃m L -1㊂表3 纤维素降解菌株初步筛选(滤纸)菌株降解度菌株降解度菌株降解度M D J 39-1+++M D J 39-12++M D J 39-23+++M D J 39-2+M D J 39-13+++M D J 39-24-M D J 39-3-M D J 39-14++M D J 39-25++M D J 39-4-M D J 39-15-M D J 39-26-M D J 39-5+++M D J 39-16+M D J 39-27++M D J 39-6+M D J 39-17+M D J 39-28+M D J 39-7+M D J 39-18-M D J 39-29+++M D J 39-8+M D J 39-19+++M D J 39-30-M D J 39-9+M D J 39-20+M D J 39-31+++M D J 39-10-M D J 39-21+++M D J 39-32+++M D J 39-11-M D J 39-22+++M D J 39-33+++注:+表示菌株的降解能力;-表示菌株无降解能力㊂以酶活较高的M D J 39-33㊁M D J 39-31㊁M D J 39-23㊁M D J 39-21㊁M D J 39-13功能菌株编号为真菌1号㊁真菌2号㊁细菌3号㊁细菌4号和细菌5号,对5株功能菌株的酶活性测定(表6)㊂结果显示:滤纸酶活:真菌1号>细菌4号>细菌5号>细菌3号>真菌2号;C M C 酶活:真菌1号>真菌2号>细菌4号>细菌3号>细菌5号;C 1酶活:细菌5号>真菌1号>细菌3号>细菌4号>真菌2号;β-G C 酶活:真菌1号>细菌3号>细菌5号>细菌4号>真菌2号㊂可见滤纸酶活㊁C M C 酶活㊁β-G C 酶活最高的均是真菌1号,分别为43.25,50.10和44.18U ㊃m L -1,细菌5号的C 1酶活最高,为0.62U ㊃m L -1㊂表4 纤维素降解菌株复筛菌株编号酶活/(U ㊃m L -1)M D J 39-14.05M D J 39-52.10M D J 39-1310.54M D J 39-191.65M D J 39-2111.32M D J 39-222.79M D J 39-2312.56M D J 39-298.78M D J 39-3117.04M D J 39-325.29M D J 39-3321.558512期 孟祥海等:食用菌菌渣高效降解菌的筛选及主菌株产酶环境优化表5 功能菌株在不同培养基上的F P A 酶活单位:U ㊃m L -1培养基M D J 39-13M D J 39-21M D J 39-23M D J 39-31M D J 39-33D u b o s 纤维素培养基(E )13.0215.5023.4125.5418.19蛋白胨纤维素培养基(F )30.2124.6225.1220.2041.55表6 功能菌株的酶活性测定单位:U ㊃m L -1菌株滤纸酶活C M C 酶活C 1酶活β-G C 酶活真菌1号43.25ʃ0.0250.10ʃ0.150.60ʃ0.1944.18ʃ0.47真菌2号15.94ʃ0.1547.20ʃ0.030.38ʃ0.716.45ʃ0.38细菌3号23.25ʃ0.0538.52ʃ0.200.54ʃ0.1613.37ʃ0.67细菌4号31.24ʃ0.0741.30ʃ0.110.39ʃ0.5011.44ʃ0.66细菌5号27.01ʃ0.1337.23ʃ1.680.62ʃ0.7312.71ʃ0.332.3 纤维素降解功能菌株的分子生物学鉴定以酶活较高的M D J 39-33㊁M D J 39-31㊁M D J 39-23㊁M D J 39-21㊁M D J 39-13功能菌株编号为1号~5号的基因组D N A 为模板,将3株细菌利用细菌通用引物27F /1492R 进行P C R 扩增,2株真菌通用引物I T S /1I T S 4R 扩增,利用1%的琼脂糖凝胶对P C R 产物进行检验㊂如图1所示,两株真菌在500~750b p 之间出现明显的荧光条带,3株细菌在1000~2000b p 之间出现明亮的荧光条带㊂测序后将16S r D N A 区片段和I T S 片段的测序结果在N C B I 数据库中进行B L A S T 比对,筛选出同源性较高的序列,并采用M e ga 软件的N e i g hb o r -j o i n i n g 法并构建系统发育树(图2~图6)㊂序列比对结果表明,1号菌株与聚多曲霉(A s p e r g i l l u s s yd o w i i N R131259)的亲缘关系最近,将其鉴定为聚多曲霉,2号菌株与日龄镰孢菌(F u s a r i u m p se u d o n y g a m a i MH 862656)的亲缘关系最近,将其鉴定为日龄镰孢菌㊂3号菌株与溶血性葡萄球菌(S t a p h yl o c o c c u s h o m i n i s M F 678883)的亲缘关系最近,将其鉴定为溶血性葡萄球菌㊂4号菌株与博代氏杆菌(B o r d e t e l l ape t r i i D S M12804A J 249861)的亲缘关系最近,将其鉴定为博代氏杆菌属㊂5号菌株与爪哇产碱菌(A l c a l i g e n e s j a v a e n s i s A B 914514)的亲缘关系最近,将其鉴定为爪哇产碱菌㊂1~5泳道.分别为菌株M D J 39-33㊁M D J 39-31㊁M D J 39-23㊁M D J 39-21和M D J 39-13;M.M a r k e rD L 2000㊂图1 菌株1~5号的P C R产物电泳图图2 1号菌株的进化树分析95黑龙江农业科学12期图32号菌株的进化树分析图43号菌株的进化树分析图54号菌株的进化树分析图65号菌株的进化树分析0612期 孟祥海等:食用菌菌渣高效降解菌的筛选及主菌株产酶环境优化2.4 主要纤维素降解菌株产酶环境条件2.4.1 直观分析 对酶活性最高的M D J 39-33菌株进行产酶环境优化,由表7可知,T6处理的半纤维素酶活和各纤维素酶活最高,为较优的产酶环境,即菌渣30g ㊃L -1㊁硫酸铵3g ㊃L -1㊁吐温-801.4m L ㊃L -1㊁K H 2P O 41.0g ㊃L -1㊁M g S O 4㊃7H 2O 1.0g ㊃L -1㊁N a C l 0.5g ㊃L -1㊁F e S O 4㊃7H 2O0.1g ㊃L -1,培养时间为7d㊂表7 不同产酶环境对M D J 39-33菌株半纤维素酶和纤维素酶活力的影响处理F P AC M CC 1β-葡萄糖苷酶半纤维素酶T 113.5ʃ0.09330.4ʃ0.2920.7ʃ0.00726.0ʃ0.24023.2ʃ0.170T 214.9ʃ0.06334.8ʃ0.3210.8ʃ0.01231.8ʃ0.32524.7ʃ0.160T 318.6ʃ0.09740.7ʃ0.3090.8ʃ0.00649.3ʃ0.55327.1ʃ0.202T 416.0ʃ0.08239.7ʃ0.1050.8ʃ0.01432.1ʃ0.47627.5ʃ0.260T 519.6ʃ0.08943.8ʃ0.1990.9ʃ0.00941.7ʃ0.31833.6ʃ0.162T 633.1ʃ0.10156.2ʃ0.2271.0ʃ0.00757.6ʃ0.52140.6ʃ0.178T 720.1ʃ0.08552.8ʃ0.3970.9ʃ0.01047.8ʃ0.52437.6ʃ0.2592.4.2 回归分析 将菌渣(x 1)㊁硫酸铵(x 2)㊁培养时间(x 3)和吐温-80(x 4)作为自变量,酶活(y )作为因变量,采用逐步回归法建立各酶活的多元非线性回归方程,如表8所示㊂各方程的决定系数(R 2)较高,说明各方程拟合度较好㊂表8 酶活回归方程酶回归方程F P A y =22.61x 24-0.01x 21+0.77x 1+0.63x 2-27.37x 4-0.38x 3x 4+13.65(R 2=0.983)C M Cy =-0.1x 23+0.49x 1+0.32x 1x 4+28.63(R 2=0.921)C 1y =-0.01x 23-0.71x 24+0.21x 2x 4+1.0x 3x 4+0.89(R 2=0.564)β-葡萄糖苷酶y =0.59x 1+24.99x 4-1.58x 3x 4+20.41(R 2=0.877)半纤维素酶y =0.47x 1-21.97x 4-0.37x 2x 3+6.43x 2x 4+0.96x 3x 4+28.37(R 2=0.922) 根据各酶活的回归方程可推导出理论最高酶活与最佳产酶条件(表9)㊂与硫酸铵浓度无关的是C M C 酶活和β-葡萄糖苷酶,与菌渣量无关的是C 1酶活㊂FP A 酶活代表了纤维素酶系活力综合作用效果,因此在实践中可作为产纤维素酶环境优化的指标㊂虽然产半纤维素酶和纤维素酶的环境在培养时间上有一定的差异,但半纤维素酶活在培养时间为15d 时,根据方程推导理论最佳酶活为46.3U ㊃m L -1,仍保持较高的酶活力㊂理论上产半纤维素酶和纤维素酶的最优环境是菌渣35g ㊃L -1㊁硫酸铵3.5g ㊃L -1㊁吐温-801.4m L ㊃L-1㊁K H 2P O 41.0g ㊃L -1㊁M g S O 4㊃7H 2O1.0g ㊃L -1㊁N a C l 0.5g ㊃L -1㊁F e S O 4㊃7H 2O0.1g ㊃L -1,培养时间为15d㊂在理论最优产酶环境下,重复10次试验验证,各酶活实际值与理论之间差异均不显著(P >0.05)㊂表9 理论最佳酶活力和产酶环境酶最高酶活/(U ㊃m L-1)产酶环境菌渣/(g ㊃L -1)硫酸铵/(g㊃L -1)时间/d吐温-80/(m L ㊃L-1)F P A 35.0353.531.4C M C61.435-31.4C 119.3-3.5151.4β-葡萄糖苷酶69.435-31.4半纤维素酶46.3353.5151.43 讨论菌渣结构复杂,木质素含量较高,自然降解速度缓慢,而低温一直是影响废弃菌渣还田后难以快速分解的主要因素㊂国内外当前菌渣降解菌研究多集中在中温和高温阶段,且以菌渣与畜禽粪便(比例较高)混合堆肥为主,工作量大,成本高,难以大面积推广使用㊂本试验研究采用微生物提16黑 龙 江 农 业 科 学12期取物与低温诱导驯化技术,以当地土著微生物存在载体-食用菌菌渣及土壤等物料为低温降解菌的菌源提取材料,不存在外来菌源对本区域菌体污染的问题㊂国内外目前缺少有关单独菌渣高效降解菌的研究,菌渣降解的实质就是酶解过程,丁寅寅等[24]对食用菌菌渣中酶的利用进行了研究,发现菌渣中含有大量的木质素降解酶,主要有漆酶㊁木质素过氧化物酶及纤维素酶等㊂微生物降解法因其能够提高废弃物利用效率㊁保护环境且耗能小,已被广泛关注㊂菌渣的粗纤维结构十分复杂,其分解是一门复杂的酶学过程,研究其在基质化利用中降解纤维素的方法主要围绕利用微生物制造纤维素酶进行研究[25]㊂当前降解纤维素的微生物主要有细菌㊁真菌和放线菌三类[26]㊂已知的产纤维素酶的细菌主要有梭菌属㊁芽孢杆菌属㊁单胞菌属和枝孢菌属等,佀胜利等[27]研究从森林腐熟土壤中筛选出一株产纤维素降解菌D T 13,经形态学㊁革兰氏染色和分子生物学鉴定确定D T 13为枯草芽孢杆菌(B a c i l l u s s u b t i l i s ),通过设计单因素试验与正交试验对菌株D T 13产纤维素酶条件进行优化,确定其最佳产酶条件为初始p H 7.0㊁发酵温度40ħ㊁发酵时间96h ㊂就应用而言,对纤维素酶的研究大多集中在青霉㊁曲霉㊁木霉等真菌上㊂因真菌在生长过程中产生大量穿透力强的菌丝,并附着在物质表面,通过增大接触面积加快其降解速率,且真菌在酸性条件下能分泌大量胞外酶,加快纤维素降解的过程[28]㊂李子婧等[29]筛选到1株高效纤维素降解率的木霉真菌(T r i c h o d e r m al o n g i b r a c h i a t u m Z J -10),在最适条件下测定的菌株Z J -10的酶活力可达到80.32U ㊃m L -1㊂链霉菌是土壤中优势的放线菌群,在高温和碱性条件下仍然具有较高的酶活性,赖国栋等[30]在土壤中分离出3株具有高效降解纤维素功能的链霉菌菌株,其纤维素酶活分别达到37.714,30.694和25.336U ㊃m L -1㊂虽然关于纤维素降解的菌株目前已经报道,但用于处理食用菌菌渣的较少,且酶活较低,本试验筛选出具有高效降解纤维素的菌株为聚多曲霉,在培养时间为15d 时,半纤维素酶活最高可达到46.3U ㊃m L -1,该菌株对食用菌菌渣降解功能的研究具有重要的应用前景㊂4 结论本研究从黑龙江省采集的样品中,筛选分离得到5株纤维素降解菌株,其中降解能力最强的为真菌GM D J 39-33,经分子生物学鉴定属于聚多曲霉㊂产半纤维素酶和纤维素酶的最优条件是菌渣35g ㊃L -1㊁硫酸铵3.5g ㊃L -1㊁吐温-801.4m L ㊃L-1㊁K H 2P O 41.0g ㊃L -1㊁M g S O 4㊃7H 2O1.0g ㊃L -1㊁N a C l 0.5g ㊃L -1㊁F e S O 4㊃7H 2O0.1g ㊃L -1,培养时间为15d ㊂参考文献:[1] W I L L I AM SBC ,M c MU L L A NJT ,M c C A H E YS .A n i n i t i a la s s e s s m e n t o f s p e n tm u s h r o o mc o m p o s ta sa p o t e n t i a l e n e r g yf e e d s t o c k [J ].B i o r e s o u r c e T e c h n o l og y ,2001,79(3):227-230.[2] P H A NC W ,S A B A R A T N 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e 1,Y A N GB i n g 1,L IY u m e i 2,W A N G Y a n f e n g 1,W A N GJ i n h e 1,W A N G X i n g m i n g3(1.M u d a n j i a n g B r a n c h ,H e i l o n g j i a n g A c a d e m y o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,M u d a n j i a n g 157000,C h i n a ;2.H e i l o n g j i a n gI n s t i t u t e o fB l a c kS o i l P r o t e c t i o na n dU t i l i z a t i o n ,H a r b i n150086,C h i n a ;3.A g r i c u l t u r a lT e c h n o l o g y E x t e n s i o n C e n t e r o fD o n g n i n g ,M u d a n j i a n g 157299,C h i n a )A b s t r a c t :I no r d e r t o s c r e e n a c o m p o u n d s t r a i n t h a t c a n e f f i c i e n t l y d e g r a d ew a s t em u s h r o o mr e s i d u e ,e f f e c t i v e l yp r o m o t e t h e d e g r a d a t i o nr a t eo fm u s h r o o mr e s i d u e ,a n dd e t e r m i n e t h eo pt i m a l f e r m e n t a t i o ne n v i r o n m e n t f o r t h em a i n f u n c t i o n a l s t r a i n so f t h ec o m p o u n ds t r a i n .T h e i n d o o r t e s tm e t h o dw a su s e dt os c r e e n205b a c t e r i a l s o u r c em a t e r i a l sc o l l e c t e db y e n r i c h m e n tc u l t u r e ,l i m i t e ds u b c u l t u r ea n dl o w -t e m p e r a t u r e g e n e r a t i o nb yg e n e r a t i o n d o m e s t i c a t i o n t e c h n o l o g y .T h e b e s t b a c t e r i a l s o u r c e e x t r a c t i o nm a t e r i a l sw e r e s e l e c t e d t h r o u gh t h e d e t e r m i n a t i o n o f c e l l u l a s e a c t i v i t y .A tt h es a m et i m e ,t h e m a i nf u n c t i o n a ls t r a i n s w e r ei s o l a t e db y s t r e a kc u l t u r e ,a n dt h e e n z y m e p r o d u c t i o n c o n d i t i o n s o f t h e s t r a i n sw e r e o p t i m i z e d .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t am a t e r i a lw i t h t h e s t r o n g e s t c e l l u l o s e d e g r a d a t i o na b i l i t y w a s i s o l a t e da n d p u r i f i e d f r o m205b a c t e r i a l e x t r a c t s .I tw a s f o u n d t h a t t h e s t r a i n b e l o n g e d t o A s p e r g i l l u s ,a n dt h e m a i ns t r a i n w i t hh i g he n z y m e p r o d u c t i o n w a s A s p e r g i l l u s s yd o w i i .T he o p t i m i z a t i o nof e n z y m e p r o d u c t i o nc o n d i t i o n so f t h es t r a i ns h o w e dt h a t t h eo p t i m a l c o n d i t i o n s f o r p r o d u c i n gh e m i c e l l u l a s e a n d c e l l u l a s ew e r e 35g ㊃L -1o f b a c t e r i a l r e s i d u e ,3.5g ㊃L -1o f a m m o n i u ms u l f a t e ,1.4m L ㊃L -1o fT w e e n -80,1.0g ㊃L -1o f K H 2P O 4,1.0g ㊃L -1o fM g S O 4㊃7H 2O ,0.5g ㊃L -1o fN a C l ,0.1g ㊃L -1o f F e S O 4㊃7H 2O,t h e i n c u b a t i o n t i m ew a s 15d a y s .T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y i d e n t i f i e d t h em a i n f u n c t i o n a l s t r a i n s i n t h e c o m pl e x s t r a i n s a n dt h e i rf e r m e n t a t i o ne n v i r o n m e n t ,w h i c h p r o v i d e dv a l u a b l er e s o u r c e sf o rt h er a p i dd e g r a d a t i o no f w a s t eb a c t e r i a l r e s i d u er e s o u r c e sa n d p r o v i d e dt e c h n i c a lb a s i s f o r t h eu t i l i z a t i o no fb a c t e r i a l r e s i d u er e s o u r c ef e r t i l i z e r .K e yw o r d s :e d i b l e f u n g i ;w a s t eb a c t e r i a l r e s i d u e ;c e l l u l o s e d e g r a d i n g b a c t e r i a ;s c r e e n i n g ;e n z y m a t i c c o n d i t i o n s 36。

不同菌种对呕吐毒素脱毒效果的研究毛定雨李永祺刘颖焦小丽*（天津农学院动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津300392）摘要本文选择短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌为脱毒菌种，研究3种菌种的上清液、菌悬液和细胞悬浮液对呕吐毒素（DON ）的脱毒效果。

选择脱毒效果较好的处理进行单因素试验设计，研究其在不同温度（35、45、55℃）、不同pH 值（5、7、9）下的脱毒效果。

结果表明，3种菌种的上清液、菌悬液、细胞悬浮液均对DON 有脱毒作用，其中短小芽孢杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌上清液、地衣芽孢杆菌上清液的脱毒率最高，分别为54.74%、63.32%、57.68%；其最适温度分别为55、45、45℃，脱毒率分别达到74.35%、75.50%、83.51%，显著高于其他温度下的脱毒率（P <0.05）；其最佳pH 值分别为7、5、5，脱毒率分别达到72.89%、70.81%、75.60%，显著高于其他pH 值下的脱毒率（P <0.05）。

关键词呕吐毒素；短小芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌；地衣芽孢杆菌；脱毒效果中图分类号S816文献标识码A文章编号1007-5739（2024）01-0176-04DOI ：10.3969/j.issn.1007-5739.2024.01.041开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Detoxification Effects of Different Strains on DeoxynivalenolMAO DingyuLI YongqiLIU YingJIAO Xiaoli *(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultural University /Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry,Tianjin 300392)AbstractThis paper selected Bacillus pumilus ,Bacillus subtilis ,and Bacillus licheniformis as the detoxificationstrains to study the detoxification effects of the supernatants,bacterial suspensions,and cell suspensions of the three strains on deoxynivalenol (DON),selected a treatment with better detoxification effect and conduct a single factor experi-mental design to study its detoxification effect at different temperatures (35,45,55℃)and pH values (5,7,9).The resultsshowed that the supernatants,bacterial suspensions,and cell suspensions of the three bacterial strains all had detoxi-fication effects on DON.Among them,Bacillus pumilus suspension,Bacillus subtilis supernatant,and Bacillus licheni-formis supernatant had the highest detoxification rate,which reached 54.74%,63.32%,and 57.68%,respectively,theoptimal temperatures were 55,45,45℃,and the detoxification rates reached to 74.35%,75.50%,and 83.51%,respectively,which were significantly higher than those of other temperatures (P <0.05);the optimal pH values were 7,5,and 5,respectively,and the detoxification rate reached to 72.89%,70.81%,and 75.60%,which were significantly higher than those of other pH values (P <0.05).Keywordsdeoxynivalenol;Bacillus pumilus ;Bacillus subtilis ;Bacillus licheniformis ;detoxification effect呕吐毒素（deoxynivalenol ，DON ），又称为脱氧雪腐镰刀菌烯醇，因可引起猪呕吐而得名[1]。

香菇母种组织分离控制褐变的实验研究臧玉红【摘要】为降低香菇母种组织培养过程中外植体的褐变程度,从菌块的大小、菌种的表面消毒时间、培养基的新鲜程度、培养基中活性炭及琼脂的含量进行综合实验.结果表明:菌块大小选择在0.5 ～0.9 cm2,升汞消毒时间保持在3～5 min,使用活性炭含量为0.2％～0.4％,琼脂含量为2.0％～4.0％,新鲜度为4d内的培养基,能有效地控制褐变,并使菌丝生长健壮.【期刊名称】《承德石油高等专科学校学报》【年(卷),期】2016(018)002【总页数】5页(P13-16,40)【关键词】香菇;褐变;组织分离【作者】臧玉红【作者单位】承德石油高等专科学校化学工程系,河北承德067000【正文语种】中文【中图分类】S646香菇享有“菇中皇后”等美称[1]，随着人们对香菇营养价值和保健功能的认识，栽培面积不断扩大，培养过程中褐变等问题也凸显出来，直接制约着香菇业的发展[2-3]。

褐变是指外植体在培养过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步褐变而死亡的现象。

褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐色，而且对许多酶也有抑制作用。

香菇组织分离培养过程中，组织块褐变现象严重，前期影响菌丝生长，后期将培养基染成褐色，从而影响母种分离成功率和质量[4-5]。

本实验利用香菇菌柄、菌盖交接处的组织作为外植体，从接种组织块大小、消毒时间、培养条件等方面，研究物理和化学因素对香菇离体培养中外植体褐化的影响，以期将褐变控制在最低程度，提高离体快繁效率，为香菇工厂化育苗奠定技术基础。

1.1 实验材料香菇(品种939)，食用菌生产大棚采摘；琼脂、活性炭等化工商店采购，分析纯。

1.2 实验仪器超净工作台、培养箱、高压灭菌锅、微生物培养室、试管、三角瓶等。

1.3 实验设计1.3.1 接种组织块大小对褐变的影响分别选用0.1 cm3、0.3 cm3、0.5 cm3、0.7 cm3、0.9 cm3、1.1 cm3六种不同大小的组织块进行接种，每种组织块接种试管20支试管，每支两粒，观察记录组织块变化及菌丝生长状况。

•论著•5型肺炎球菌结合物原液中游离多糖分离方法的建立及验证任珍芸刘倩李献林杨英英马凯凯李阿妮陈晓航李燕婷任克明谭小梅罗树权兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室730046通信作者：罗树权，Email:sqluo@【摘要】目的建立和验证有效分离5型肺炎球菌结合物原液(结合物原液）中游离多糖的方法，以供测定游离多糖含量。

方法通过游离多糖添加回收率试验以及氯化钠浓度对咔唑-硫酸法吸光度值影响试验,选择结合物原液中游离多糖和多糖-蛋白结合物分离时最佳的氯化钠浓度;通过蛋白回收率试验筛选出该条件下所能沉降蛋白质的浓度范围；比较标准曲线经脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate，N a D Q/H C l法处理前后吸光度值的变化，验证N a D C/H C l法对多糖含量检测的影响;对所建立方法的专属性、精密度及准确度进行验证。

结果 N a D C/H C l法处理结合物原液时的最佳氯化钠浓度为(U5 mol/L;结合物原液中蛋白浓度在100 jug/ml以内，N a D C/H C l法能实现蛋白质的完全沉淀;N a D C对多糖含量检测无干扰;该方法专一沉淀蛋白质，而对游离多糖无影响；准确度验证试验的回收率在93. 17%〜102. 59%之间；日间以及日内的精密度变异系数均小于10%。

结论N a D C/H C l法能充分分离结合物原液中的多糖-蛋白结合物和游离多糖，具有良好的准确度和重复性，适用于5型肺炎球菌结合物原液中游离多糖含量的测定。

【关键词1肺炎球菌菌苗；疫苗，结合；多糖类；脱氧胆酸；破伤风类毒素基金项目：国家科技重大专项“重大新药创制”(201«ZX09738-U(>6)【中图分类号】R967 D O I： 10. 3760/cma. 311962-20200803-00079Establishment and verification of a separation method for free polysaccharide in type 5 pneumococcalpolysaccharide conjugateRen Zhenyun，Liu Q ian,Li X ia n lin，Yang Yingyi?ig»Ma K a ika i，Li A n i»Chen X iaohang，LiY anting，Ren Kerning，Tan Xiaom ei，Luo ShuquanNo. 1Research Laboratory，Lanzhou Institute o f Biological Products Co.，L td.，Lanzhou 730046，ChinaCorresponding author ：Luo Shuquan ^EtnaiL：****************【Abstract】Objective To develop and verify a separation method for free polysaccharide(PS)content detection i n type 5 pneumococcal polysaccharide conjugate. Methods Based on the results ofadded PS recovery test and influence of NaCl concentration on the absorbance value，the optimalconcentration of NaCl in the samples was determined. Then the concentration range of carrier proteinprecipitated was screened by protein recovery t e s t.Afterwards, glucuronic acid standard was precipitatedwith sodium deoxycholate (NaDC)/HCl and compared with the normal standard to evaluate effect ofN a D C on determination result. The specificity, accuracy and precision of this method were v e r i fied.Results The optimal concentration of NaCl i s 0. 15 mol/L. Protein was completely precipitated a tconcentration of less than 100 N a D C did not interfer with the detection results. This method hadgood specificity and the recovery rate was between 93. 17% and 102. 59%. Besides, this method showedhigh precision both i n intra- and inter-assays, with coefficients of variation of less than 10%.Conclusion Free PS can be separated completely from the conjugate precipitated with NaDC/HCl-indicating this method has superior accuracy and repeatability, suitable for detection of free PS content i n type 5 pneumococcal conjugate.[Key words】Pneumococcal vaccines；Vaccines，conjugate; Polysaccharides；Deoxycholic acid; Tetanus toxoidFund program：National Science and Technology Major Project 44Major N e w Drugs Innovation and Development,,(2()18ZX09738-()06)D()I： 10. 3760/cma. 311962-2()2008()3-()()()79多糖-蛋白结合疫苗中游离多糖含量的控制是 结合疫苗质量控制的重要组成部分，建立精密、准确 测定游离多糖含量的方法对疫苗研发至关重要。