关于内皮细胞和平滑肌细胞在微孔聚碳酸酯膜上共培养模型方法

关于内皮细胞和平滑肌细胞在微孔聚碳酸酯膜上共培养模型方法【关键词】平滑肌细胞关键词: 血管内皮细胞;平滑肌细胞;细胞培养;缝隙连接摘要:目的探讨主动脉内皮细胞（EC）和平滑肌细胞（SMC）共培养模型，为下一步研究两者之间的电生理活动提供基础. 方法采用微孔聚碳酸酯膜（polycarbonate filter membrane）作为载体，将EC和SMC接种于微孔膜的两侧，建立EC和SMC联合培养模型，模拟血管壁EC和SMC间的结构关系，采用倒置显微镜和透射电镜进行观察. 结果共培养的EC和SMC组织结构关系类似于体内，EC呈单层生长，而SMC呈多层生长，同类和异类细胞间都有缝隙连接形成，缝隙连接的形成与培养的时间有关，在SMC接种后24h，EC可以通过微孔与SMC形成缝隙连接. 结论此种EC和SMC共培养模型模拟了在体时EC和SMC之间的结构关系，可以用来研究两种细胞间的相互影响.Keywords:vascular endothelial cells;smooth muscle cells;cell culture;gap junctionAbstract:AIM To develop a method of endothelial and smooth muscle cells co-culture by which we can study the electrophysiologicalactivities between two kinds of cells.METHODS Endothelial and smooth muscle cells were grown on opposite sides of microporous polycarbonate filters.The interactions between cells were examined by inverted microscopy and transmission electron microscopy.RESULTS Status of theco-cultured cells was similar to that in vivo.Relative to theendothelial cells monolayer，the smooth mus-cle cells weremultilayer.There were many gap-junctions a-mong the endothelial cells and smooth muscle cells respec-tively.The heterocellular gap-junctions also existed between the two kinds of cells.The number of the myoendothelial junctions had respect to the co-culturing time.After SMCs were seeded on the filter，the ECs and SMCs formed the gap junctions through the micropores within24h.CONCLUSION This new co-culture method might be a promising in vitro model for studies of interactions between endothelial and smooth muscle cells.0 引言血管内皮细胞（endothelial cell，EC）和平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）之间的信号转导可以通过两种方式进行:①通过细胞间的体液性信息联系;②通过细胞间缝隙连接的接触性信息联系.前者涉及到一系列的细胞因子，由EC释放，而SMC上面有相应的受体［1］，如:内皮依赖性舒张因子（EDRF）.在缝隙连接中，同类或异类细胞之间通过缝隙可进行离子和代谢产物的传递等.血管EC和SMC间的缝隙连接具有方向性和电荷选择性，缝隙连接的多寡在血管的不同节段和不同的器官组织是不同的［2，3］ .这两种细胞的体液性及接触介导性信息联系对维持血管壁自身稳定有重要意义，这种信息联系的失衡可能与SMC的增生、动脉粥样硬化的发生有直接的联系［4］ .目前比较好地模仿生物体内EC和SMC关系的培养模型有微载体技术以及灌注跨毛细血管平滑肌内皮细胞共培养模型［5，6］，能够模仿体内的血流动力学环境，但其技术要求高，一般实验室不易实现.我们采用了微孔聚碳酸酯膜作为EC和SMC共培养的载体，该模型可以模仿体内EC和SMC的组织结构关系，在此基础上，利用倒置显微镜和透射电镜观察了两种细胞的生长情况和细胞间缝隙连接情况，为下一步研究两者间的电生理活动提供了保障.1 材料和方法1.1 材料牛主动脉取自健康屠宰小牛;SD大鼠仔鼠（第四军医大学实验动物中心）;1640培养基（Gibco）;加强小牛血清（Hyclone）;聚碳酸酯膜（10mm×15mm，厚12μm，孔径5μm，孔密度2800 mm-2 ，Millipore公司）;2g L-1 明胶（Gibco）.1.2 方法1.2.1 牛主动脉EC（BAEC）和仔鼠SMC的分离和鉴定按我们已建立的方法培养并鉴定牛主动脉EC和仔鼠胸主动脉SMC［7］，利用2～5代细胞进行实验.1.2.2 EC和SMC的共培养①聚碳酸酯膜的准备:取聚碳酸酯膜0.15MPa20min 高压消毒后备用，用前用明胶包被，培养箱内孵育3h，PBS浸洗后接种细胞;②共培养:按密度1×104 cm-2 将内皮细胞接种于聚碳酸酯膜的一侧，常规培养24h后翻转聚碳酸酯膜，将平滑肌细胞接种于膜的另一侧，24h后换液，以后每日换液1次，常规倒置显微镜观察，取接种后1，3和4d共培养标本进行透射电镜观察.1.2.3 透射电镜（TEM）标本的准备［8，9］取出两侧长有细胞的聚碳酸酯膜，用预热的PBS漂洗，然后在含25g L-1 戊二醛，0.1mol L-1 二甲胂酸钠溶液（pH7）里固定1h，20℃，再用10g L-1 四氧化锇固定1h，20℃，用1g L-1 的鞣酸染色，1h，20℃，来加强对比，然后用梯度乙醇逐级脱水，之后把标本浸于乙醇-EPON（1 1）中，1h，20℃，最后用EPON-环氧树脂包埋.用刀片将包埋块切成小块，垂直细胞层作超薄切片，用150目碳包被的铜网收集，然后用100g L-1 醋酸双氧铀和4g L-1 柠檬酸铅染色.2 结果2.1 SMC和EC在聚碳酸酯膜上生长情况细胞在接种2h后开始在膜上贴附延伸，接种1d后EC逐渐融合，呈单层生长，细胞呈多边形.SMC在接种1d后细胞之间开始融合，对数生长，至第2日可见SMC融合，EC外形呈明显伸长改变，细胞边界清楚.第3日SMC开始出现细胞分层生长，EC生长减慢.至第4日时两种细胞出现衰退现象.图1 －图6 略2.2 SMC和EC在聚碳酸酯膜上同类和异类细胞间缝隙连接形成的超微结构透射电镜结果显示，共培养1d后的EC和SMC在膜上呈单层生长状态，可观察到EC 之间的缝隙连接（Fig1），聚碳酸酯膜孔内可见细胞突起（Fig2），EC和SMC通过微孔之间形成缝隙连接（Fig3），在缝隙连接形成处可见两个细胞的质膜互相靠拢，其间有2～3nm的缝隙，其中可见电子密度较高的颗粒组成的虚线状结构.共培养后第3日时，可以看到EC穿过微孔生长到膜的另一侧（Fig4），到对侧与SMC形成缝隙连接，且缝隙连接形成的多少与共培养的时间有关，经过电镜观察到在接种SMC1d后，穿过微孔的EC有30%～40%可以与对侧的SMC形成缝隙连接，而在第3日就可以达到70%～80%.还可以观察到SMC呈现多层生长现象（Fig5）.至第4日时SMC明显发生退变，底层SMC开始分解（Fig6）.3 讨论EC和SMC的相互关系越来越引起大家的兴趣，人们正在努力寻求一种好的模型，能够模仿体内两者间的结构关系，便于在微观上研究二者的相互关系.本实验采用的聚碳酸酯膜作为EC和SMC共培养的载体，观察两种细胞之间的连接情况.实验中观察到EC保持了单层生长状况，而SMC可多层生长，而且两种细胞之间的缝隙连接也与体内相似.由于EC首先接种，且密度比较高，因此，1d后即形成单层生长，近于融合状态，且可以通过多聚碳酸脂膜间的微孔迁移到对侧生长，在滤膜另一侧接种SMC1d后，EC和SMC之间即可形成缝隙连接，且随着共培养时间的延长，两种细胞间形成的缝隙连接越多.表明利用该方法可以模拟在体时血管EC和SMC之间的组织结构关系，从而为进一步的研究奠定了基础.EC处于血管腔和中膜SMC层之间，尤其是在肌性血管中，血液流动速度很快，这就决定了EC和SMC之间的协调平衡对保证血管正常的张力具有重要意义.在流体切力作用下，EC把信息传递给SMC，目前认为有两种途径:①EC分泌一些特定的细胞因子，如:内皮依赖性舒张因子（EDRF）、内皮依赖性超级化因子（EDHF）、前列腺素（PG）、P物质（SP）等［10，11］;②通过EC和SMC两者之间的缝隙连接，EC可以把感受到的信息直接传递给SMC［3，12］，以保证血管的正常张力.流体对血管的作用是一种基本的生理刺激，自Furchget发现EC在血管张力调节中所起的关键作用以来，人们对内皮依赖性血管张力调节进行了广泛的研究，发现EDRF，EDHF等，但对 EC 如何感受流体、切应力的变化，并且将机械信号转导为电信号或化学信号的过程尚不十分清楚［13］，一些研究证实流体切应力大小的变化可以通过血管源性物质而调节血管张力［14］ .血管内血流量的调节主要位于肌性血管，并且发现EC和SMC之间广泛存在缝隙连接，且管径越细，这种结构越多，有的EC向SMC中伸起形成所谓的肌内皮结构（myo-en-dothelial junctions）.而当EC和SMC体内的缝隙连接逐渐被认识后［15，16］，人们就倾向于后一种途径了，认为EC把信息直接传递给SMC.Duling发现血管EC与SMC之间的缝隙连接具有方向性和电荷选择性，提出其在血管张力调节中可能起重要作用［2］，但目前关于这方面的研究相对较少.为观察流体切应力作用EC后SMC的电生理变化，我们设计了此共培养模型，该模型的优点可以模拟正常血管中EC与SMC之间的影响外，还可以将不同来源的EC和SMC组合培养，便于探讨不同器官和部分血管张力调节的异同.同时利用此模型可以实验各种因素作用EC后SMC的反映，更符合生理情况.目前能够很好模仿EC和SMC体内状况的模型是灌注跨毛细血管共培养模型，可以研究在流体切力作用下EC的形态变化及EC和SMC代谢变化，但其成本昂贵，操作复杂;另有微载体技术，它不能模拟在体时的流体力学环境，且两者在研究流体切力作用下EC和SMC之间电生理变化，从离子水平研究流体切力的作用，就显露出它们的局限性.本实验所采用的聚碳酸酯膜模型，结果表明可以模仿体内两者之间的关系，并且还可以在其基础上采用双层灌流装置，利用膜片钳技术来研究两者之间的电生理活动情况.参考文献［1］Garland CJ，Plane F，Kemp BK，Cocks TM.Endothelium-de-pendent hyperpolarization:A role in the control of vascular tone ［J］.Trends Pharmacol Sci，1995;16（1）:23-30.［2］Little TL，Xia J，Duling BR.Dye tracer define differential en-dothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteri-olarwall ［J］.Circ Res，1995;76（3）:498-504.［3］Jean-Louis B.Endothelial and smooth muscle cells hyperpolar-ized by bradykinin are not dye coupled ［J］.Am J Physiol，1990;258（3）:H836-H841.［4］Schwartz 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