荧光显微成像技术和应用

实验二荧光显微镜的基本使用方法荧光显微术是在细胞或组织水平上对生物大分子进行定位和动态观察的最常用的实验方法。

它广泛地应用于核酸、蛋白质、细胞器、细胞骨架、激素、离子等多种细胞结构或物质的定位和功能分析。

很多生命科学的研究工作都需要频繁地使用荧光显微镜。

比如，采用荧光探针的原位分子杂交用于确定某个基因在组织中的表达或在染色体上的定位（Polak et al. 1999; Andreeff and Wiley-Liss 1999），绿色荧光蛋白基因（gfp）用于了解某个基因产物在组织和细胞中的特异性分布（Chalfie et al. 1994; Haseloff and Amos 1995）等等。

然而，在我们接触的一些低年级研究生中，一些同学并没有很好地掌握荧光显微镜的基本原理和使用方法。

他们拍摄的荧光显微照片往往不能满足国际性高水平学术刊物的要求。

这种状况既不利于科研效率的提高，也限制了研究成果的发表。

因此，了解荧光显微术中的一些基本原理和注意事项、掌握荧光显微镜的基本使用方法是非常重要和有意义的。

本实验讲解荧光显微镜的基本结构和使用方法。

要求学生通过细胞核、细胞质DNA的荧光显微显示以及转绿色荧光蛋白基因拟南芥根、茎、叶细胞的观察掌握荧光显微术的基本原理和注意事项，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

实验目的：1. 了解荧光显微镜的基本结构；2. 掌握荧光显微术的基本原理和注意事项；3. 掌握核酸的荧光显示技术，直观地认识细胞质DNA的存在；4. 了解绿色荧光蛋白（GFP）在蛋白质定位等研究中的应用，直观地认识GFP的荧光显微效果。

实验内容：1.荧光显微镜的基本原理和结构荧光显微镜的放大成像原理与普通透射光显微镜完全相同。

不同的是荧光显微镜需要另外的激发光光源和光路。

因此，只要加上激发光光源和光路，再换上允许激发光通过的目镜（荧光显微镜的目镜在透镜玻璃的材质上与普通透射光显微镜不同），一台普通的透射光显微镜就可以被升级成一台荧光显微镜了。

荧光探针在细胞成像中的应用研究随着生物学、化学、物理学等学科的发展，的确有越来越多的技术和方法用于探测、识别和描述生物体系中微观细节。

在这些涉及生物体系的技术中，有一种非常常用的技术：荧光。

由于荧光可以通过荧光显微镜等工具进行成像，所以被广泛应用于细胞成像。

而荧光探针作为荧光技术中的重要一环，其在细胞成像中的应用也引起了很多研究者的关注。

一、荧光探针的原理荧光探针能够通过与目标物相互作用而发生比荧光显微镜更方便和准确的发光效应。

因此，它在生物学的各个领域都有使用。

荧光探针可以通过吸收光子并激发成高能状态，之后重新发射荧光，从而显露出其自身存在的信息。

其中荧光的发生是由荧光分子中的定域激发的势能状态转移到其他状态引起的，这些高能状态的能量交换最终导致荧光发生。

在细胞成像领域中，荧光探针一般可用于以下几个方面：1.可用于探测特定生物分子的存在性及其在细胞中的分布情况。

2.可用于研究细胞的功能状态，比如荧光变化可能反映细胞内部不同化学物质的交互作用或共局域化。

3.可用于研究细胞间相互作用，荧光探针能够实现多种信号转换，从而研究细胞间的相互作用的程度和效果。

二、荧光探针的分类按照用途分类，可以将荧光探针分为下列几类，常见的荧光探针包括了蛋白质和DNA上的染色体荧光蛋白，荧光源，配体标记，细胞膜指示剂和选体等等。

它们可以用于生物学的各个领域，包括蛋白质结构解析，降解和合成、细胞信号转导，细胞凋亡，细胞增殖以及肿瘤细胞测量等。

1.染色体荧光蛋白染色体荧光蛋白指的是由特定基因编码的荧光蛋白，用于标记靶细胞的某些细节。

例如，绿色荧光蛋白（GFP）是在青蛙卵母细胞中首次发现的一种荧光蛋白，它可用于非侵入性地标记细胞中某些特定细节（比如软骨细胞中仅有的一组胆固醇基础树脂化细胞、神经元中的长胶质形态、心肌细胞中的可变性党参膜和肝细胞中各种细胞器）。

2.荧光源和配体标记荧光源和配体标记涉及到一种荧光探针，可用于观察细胞或者分子之间的交互作用。

多色免疫荧光技术
多色免疫荧光技术是一种基于免疫学原理的荧光显微技术，能够同时检测多种不同的蛋白质或分子，通过将不同颜色的荧光标记与不同分子或蛋白质结合，实现在同一细胞或组织中多种成分的高效鉴定和定位。

多色免疫荧光技术在细胞学、病理学以及生物医学研究中有着广泛的应用。

例如，在研究细胞信号传递、基因表达、蛋白质定位等方面，多色免疫荧光技术可以提供高分辨率、高灵敏度的成像数据；在诊断疾病时，多色免疫荧光技术可以帮助医生更准确地定位病灶。

多色免疫荧光技术的发展离不开荧光探针的不断创新和改进，目前已经出现了许多基于荧光蛋白的标记技术，如GFP、RFP、YFP等。

同时，高通量荧光显微技术的出现也为多色免疫荧光技术的应用提供了更大的空间和可能性。

总之，多色免疫荧光技术的出现和发展为细胞生物学研究和医学诊疗提供了强有力的工具和手段，也为生命科学领域的进一步发展带来了更广阔的前景。

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生物光子学大作业作业名称：荧光寿命成像技术FLIM 姓名：曾扬舰学号：完成日期：2016.6.28荧光寿命成像技术FLIM摘要：荧光寿命显微成像技术（FLIM）技术是一种新颖的荧光成像技术，具有其他荧光成像技术无法代替的优异性能，是生物医学工程领域的研究热点。

频域调制、门控探测和时间相关单光子计数是FLIM的几种主要实现方法。

综述了这些计数的原理、研究现状和已取得的部分成果，比较了这三种方法的时间分辨率和成像速度等参数的优劣。

宽场FLIM更适用于延时成像和实时成像。

荧光偏振各向异性成像和内窥镜FLIM技术都是FLIM技术很有前景的应用方向。

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy(FLIM)Why lifetime Imaging?The fluorescence lifetime is the signature of a fluorescent material ;It is the exponential decay in emission after the excitation of a fluorescent material has been stopped. FLIM is a technique to map the spatial distribution of lifetimes within microscopic images and it allows measurements in living cells as well as in fixed.Because of the fact that some phenomena do affect fluorescence lifetimes, the lifetime is used to detect these phenomena leading to various applications such as; lon imaging ,oxygen imaging, probing microenvironment, and medical dlagnosis.Frequency domain methodThe homodyne frequency domain FLIM method requires amodulated light source and a modulated detector.In the LIFE system these are the LED and the intensified CCD camere. Both are modulated at exactly the same frequency,but with an adjustable diffrence in phase.These two parameters depend on the fluorescence lifetime of the sample and the modulation frequency and are measured to calculate the flurescence lifetime in each pixel of the image.1、基本概念荧光是分子吸收能量后使得其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的辐射复合发出的光。

显微成像技术在医学中的应用如今随着科技的不断发展，显微成像技术在医学领域中的应用越来越广泛。

通过显微成像，医生们可以更加准确地进行诊断和治疗，为患者的健康和生命安全提供了更多的保障。

本文将探究显微成像技术在医学中的应用，让大家更好地了解这种高端技术的优势和局限。

一、显微成像技术简介显微成像技术是一种能够将微小物体放大成可见的图像或视频的技术。

通过显微成像技术，医生们可以将肉眼无法识别的细胞、组织、器官等微观结构放大、摆脱样本制备、陈旧数据和品质控制等传统的限制，进行更加精确的观察和分析。

常见的显微成像技术包括光学显微镜、电子显微镜、荧光显微镜、共焦显微镜、原子力显微镜等，每一种技术都有其专门的应用领域。

二、显微成像技术在医学中的应用1. 组织学病理学组织学病理学是对组织和器官的病理学变化进行研究的一门学科。

在组织学病理学中，显微成像技术被广泛应用，它可以用来观察组织和器官的病理学变化、分析细胞和组织的结构和功能，并进一步提供治疗方案。

在病理学领域，电子显微镜是非常有用的工具。

它可以通过高分辨率成像，观测细胞和组织的微观结构，帮助医生更加精准地诊断疾病。

此外，共焦显微镜也是一种常用技术，可以给予病理医生更清晰的三维组织结构，从而更加精确地进行诊断。

2. 体外诊断体外诊断是指通过实验室测试方法，对病人的生物学标志物和药物浓度的测量等进行分析，以确定病情和治疗方案。

在这个过程中，显微成像技术可以帮助医生更好地理解病人的情况。

在体外诊断过程中，荧光显微镜可以帮助医生更加清晰地观察细胞、细胞核、蛋白质、DNA和细胞器等结构。

它可以通过标记特定的物质，用荧光显微镜进行观察，来帮助诊断各种疾病。

3. 药物研发药物研发是通过对各种化合物的分析和试验，找到有效药物的过程。

显微成像技术在药物研发中起着重要的作用。

它能够帮助科学家了解化学物质的作用和生化过程，从而更好地设计药物。

共焦显微镜和原子力显微镜可以帮助科学家直接观察药物分子和细胞相互作用的过程。

激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。

它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。

本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。

一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。

在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。

与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。

换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。

对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。

二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。

1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。

在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。

荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。

2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。

双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。

在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。

荧光显微成像系统的原理及构成1.荧光染料：荧光显微成像系统通过荧光染料标记目标物体，使其发出荧光信号。

荧光染料通常是天然或合成的荧光性物质，其分子结构含有色团和荧光基团。

当荧光染料被激发光波长的光线照射后，其激发态电子跃迁至激发态，并在短时间内回到基态，释放出发射光子，形成荧光信号。

2.荧光显微镜：荧光显微成像系统使用荧光显微镜进行成像，荧光显微镜由光源、物镜、筛片轮、探测器等组成。

光源通常是弧光灯或LED，用于产生激发荧光染料所需的光的波长。

物镜具有高放大倍数和数值孔径，用于聚焦和收集荧光信号。

筛片轮可根据荧光染料的激发光波长进行选择，以过滤非目标光。

探测器可以收集和记录荧光信号，并进行图像处理与分析。

3.激发光源：激发光源是荧光显微成像系统的重要组成部分，用于产生适当波长的激发光，激发荧光染料发出荧光信号。

常见的激发光源包括白炽灯、汞灯、激光器和LED等。

不同的激发光源具有不同的波长和强度，可根据需要进行选择。

4.探测器：探测器用于收集和记录荧光信号，常见的荧光显微成像系统探测器包括光电倍增管、CCD相机和CMOS相机等。

其中，光电倍增管用于接收低强度的荧光信号，并通过电子放大将其转换为电信号；CCD相机和CMOS相机具有高灵敏度和分辨率，能够实时采集图像并记录。

1.样品台：样品台是放置生物样品的平台，通常由固定夹持装置和控制台组成。

固定夹持装置用于固定样品的位置，确保样品在成像过程中不移动或晃动。

控制台用于调节样品台的位置和倾角，以便选取最佳的成像角度。

2.激发系统：激发系统包括激发光源和筛片轮等组件，用于产生适当波长的激发光。

激发光源通常位于显微镜的下方或侧面，经由物镜进入样品。

筛片轮可根据需要选择不同的激发光波长，以过滤非目标光。

3.探测系统：探测系统包括物镜、滤光片和探测器等组件，用于收集和记录荧光信号。

物镜通过调节焦距和数值孔径，在样品上聚焦并收集荧光信号。

滤光片用于过滤非目标光，减少背景干扰。

尼康荧光显微镜技术特点一、光学系统：尼康CFI60无限远光学以其卓越的成像质量受到全球市场的高度好评，齐焦距离60mm。

对人眼观察和数字化成像都是最优的物镜：1、提升的边缘性性和平场度2、消渐光晕（亮度的差别小于5%）3、提升的紫外DAPI 和其他滤光片的焦平面的性能。

二、80i主机的标准配置配备了新的复眼透镜系统，“复眼”透镜阵列使视场边缘的光强达到视场中心光强的90%，所以完全能适用数字成像的照明。

使目镜的视场数达到25mm以上。

三、噪声消除器（H i S/N）是80i 荧光装置的标准特征，信噪比提高了5倍，电动快速低噪声马达滤光片转盘。

四、电动控制装置精巧方便，130W高效长寿命荧光装置，无需调中，滤光片电动快速转换，低噪声，使用寿命2000小时以上，同为NIKON产品，提高产品整体性，方便售后服务五、扩展了人机学性能。

新的矩形机械台：固定位手轮、扭力矩手轮调节，可延伸的工作台固定把手位、超硬铝合金工作台表面。

人机学主机。

显微镜构成尼康显微镜80i的主要构成：（如下图所示）1、80i显微镜主机2、聚光镜3、载物台及夹片器4、荧光物镜：10倍40倍100倍5、物镜转盘6、电动荧光装置：包含荧光专用激发块7、C-BOX2控制器8、双目观察镜筒及照像端口9、目镜10、视频接口11、冷CCD12、长寿命荧光光源主要可调节的部分：（如下图所示）长寿命荧光光纤照明器显微观察方法明场显微术：1 打开电源装置的开关。

将显微镜主机后面的电源开关置于“I”的位置。

电源指示灯亮。

2 按预置开关（显微镜前面的绿色按钮）打开明场照明。

3 将显微镜右下部的ND8、ND32 和NCB11 减光片移至光路中。

（NCB11是白光平衡片，ND8、ND32两个减光片分别将光强减弱为原来的1/8和1/32）4 推入目镜筒上面的光路转换杆，对准双目镜筒使光路充满5 转动激发方式转换盘放在没有激发块的空位处（打开显微镜右后面C-BOX2的开关，通过控制器选择没有荧光块的空位转入光路中）6 提升聚光镜到最高位置。