荧光显微成像系统的原理及构成

激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。

紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。

成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。

分光器将荧光直接送到探测器。

光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。

两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。

这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。

以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。

每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。

由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。

把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。

即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。

激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。

基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。

显微荧光成像技术生命科学是一个充满活力的领域，包括生物学、医学、农学、生态学等诸多分支。

显微镜是生命科学研究中不可或缺的工具之一，而显微荧光成像技术则是显微镜技术的重要分支之一。

本文将围绕显微荧光成像技术展开阐述。

一、显微荧光成像技术的基本原理显微荧光成像技术是利用荧光分子在吸收一定波长的光后，能够发出较长波长（即红外、红光、黄光）的光的特性，来探测并分析样品中各种微观结构与分子的分布情况和相互作用。

从理论上讲，这些分子在不受到荧光激发的情况下是不会发光的。

因此，要实现荧光成像需要通过激发、显微观测、成像三个步骤来完成。

激发环节是荧光成像技术的起点。

荧光分子必须要由波长与其吸收光谱相吻合的光子作用下，才能在其内部发生电子的跃迁，发出荧光信号。

一般而言，荧光分子的激发波长与发射波长是不同的。

由此，通过双光子荧光激发技术，可以用一种比传统荧光显微镜的短波长更长的激发波长来对样品进行激发，使荧光分子针对测量目的进行有选择性的激发，大大减少光伤害，同时增加激光的渗透深度，解决深部显微成像的问题。

显微观察环节是荧光成像技术的重点。

显微荧光成像技术基于荧光分子的发射特性，即它们可以在可见光谱的较长波长区域发射出光，这种现象可以被显微镜观察到。

在显微荧光成像系统中，将样品置于显微镜下，并通过荧光染料激发样品，然后通过适当的荧光滤波器对荧光发射信号进行过滤，最后将信号捕获并显示在荧光显微镜上。

成像环节是荧光成像技术的末端。

荧光显微成像系统可以将荧光信号反射到图像传感器（如CCD）上，捕获图像数据，使用显微荧光成像图像处理软件对获得的图像数据进行分析和处理，处理结果可以被投影或与其他数据交互的形式展现。

二、显微荧光成像技术的应用显微荧光成像技术应用广泛，包括生命科学、药学、医学、农业、食品工业、生态学等领域。

一些具体的应用如下：1、生命科学领域显微荧光成像技术广泛应用于生命科学领域，它可以被用来研究生物体在不同行为状态下的荧光响应，如酶活性、细胞间相互作用、细胞家族、组织结构、线粒体功能等，进一步揭示生物体的结构、功能和相互作用等相关生物学问题。

光片荧光显微成像技术摘要：光片荧光显微成像技术因其独特的优点，受到广泛关注。

从光片荧光显微镜基础入手，介绍成像原理、发展历史、研究现状及应用展望。

关键词：显微成像，荧光成像；光片照明引言显微成像技术是现代生物医学研究的重要技术手段之一，显微荧光成像技术因其特异性标记及高灵敏度高对比度的成像，而受到广泛地应用。

光片荧光显微镜一种特殊的荧光显微镜，其显著提高了传统荧光显微镜的三维成像速度，降低了光漂白以及光毒性，使得科学家们能够长时间地观察生理状况下组织细胞的生命活动，对生命科学的研究具有重要意义。

1.光片显微镜的历史显微镜是一种古老的光学仪器，历经几百年发展，形成了多个分支，广泛地应用生命科学的各个领。

荧光显微镜是利用物质荧光特性进行观察的光学显微镜，具有检出能力高、能进行多重着色观察的特点，广泛地应用于生物医学领域。

长期以来，传统荧光显微镜受限于阿贝衍射极限，分辨率都不能突破200nm；其次，激发光的光漂白及光毒性无法实现样本的长时间观察；再者，常用于活细胞研究的共聚焦荧光显微镜的成像速度太慢；无法满足生物医学研究快速成像、高分辨的要求。

薄片光的概念最早是在1903年提出的，然而直到1993年Voie才用薄片光的原理开发了正交面荧光光学切片显微镜)，样品由薄片光扫瞄成像。

二十一世纪以来，光片照明显微镜发展非常迅速，由于采用面探测的成像方式，光片照明系统能够快速获得高分辨率的三位层析结构成像，和共聚焦相比，对整体标本的光毒性小，光漂白低，适合长时称活体成像。

2004年Stelzer发明了选择薄片光显微镜,SPIM可以三维高分辩率高穿透深度成像。

2008年Stelzer改进了SPIM，改进版的SPIM可以对斑马鱼胚胎进行24小时成像并追逐胚胎发育过程中的细胞位移和分裂。

2014年，光片荧光显微镜被Nature Mehtods列入十大新技术之列，深刻改变了生物医学观察方式。

2.成像原理及结构光片荧光显微成像技术，LSFM或者selective plane叫umination microscopy，SPIM）通过对光片激荧光的宽场成像，该技术综合了成像速度和空间分辨率的优势，极小的光损伤和光漂白，广泛应用于生物样品的长时间动态活体多维成像。

全内反射荧光显微术原理与应用1. 引言全内反射荧光显微术（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的显微技术，利用全内反射限制激光光束的传播范围，使其仅激发样品表面附近的荧光染料，并通过荧光显微镜观察和记录表面附近的高分辨荧光信号。

该技术具有高灵敏度、高空间分辨率和实时监测能力等优点，广泛应用于生命科学研究中。

本文将详细介绍TIRFM的原理和应用。

2. 全内反射原理光在由一个折射率较大的介质（如光具）射入折射率较小的介质（如空气）时，当入射光线的入射角大于一个特定的临界角时，光线将会完全发生反射，不再穿透进入折射率较小的介质中。

这个现象被称为全内反射（Total Internal Reflection，TIR）。

当一个光束从高折射率的物质射入低折射率的物质时，入射角大于临界角时，发生全内反射。

通过调控入射角，可以使光线沿着介面传播，从而形成衰减系数很小的光束。

这个现象可以被用来实现TIRFM的照明光路。

3. 全内反射荧光显微术系统TIRFM系统主要由以下几个部分组成：激光光源、调制器、目标镜、物镜、荧光滤光片、成像系统和数据采集分析系统等。

激光光源：一般使用高功率激光器，如氩离子激光器或二极管激光器。

激光通过光纤输入到光路系统中。

调制器：用于控制激光的工作模式，常用的包括振荡镜或振荡腔。

目标镜：一般是具有高折射率的玻璃片或光具，用于实现全内反射，常用的目标镜材料有石英、玻璃等。

物镜：用于聚焦激光到样品表面，并收集荧光信号。

物镜的选择要考虑到激光的聚焦效果和空间分辨率。

荧光滤光片：用于选择性地阻挡激发光和透射荧光信号。

成像系统：一般是荧光显微镜或全内反射显微镜。

能够观察并记录样品表面的荧光信号。

数据采集分析系统：可以对观察到的荧光图像进行实时处理和分析，如图像增强、图像叠加、荧光强度计算等。

4. TIRFM原理TIRFM的原理可以通过以下步骤进行解释：1.激光从物镜聚焦到样品表面。

荧光显微成像系统的原理及构成1.荧光染料：荧光显微成像系统通过荧光染料标记目标物体，使其发出荧光信号。

荧光染料通常是天然或合成的荧光性物质，其分子结构含有色团和荧光基团。

当荧光染料被激发光波长的光线照射后，其激发态电子跃迁至激发态，并在短时间内回到基态，释放出发射光子，形成荧光信号。

2.荧光显微镜：荧光显微成像系统使用荧光显微镜进行成像，荧光显微镜由光源、物镜、筛片轮、探测器等组成。

光源通常是弧光灯或LED，用于产生激发荧光染料所需的光的波长。

物镜具有高放大倍数和数值孔径，用于聚焦和收集荧光信号。

筛片轮可根据荧光染料的激发光波长进行选择，以过滤非目标光。

探测器可以收集和记录荧光信号，并进行图像处理与分析。

3.激发光源：激发光源是荧光显微成像系统的重要组成部分，用于产生适当波长的激发光，激发荧光染料发出荧光信号。

常见的激发光源包括白炽灯、汞灯、激光器和LED等。

不同的激发光源具有不同的波长和强度，可根据需要进行选择。

4.探测器：探测器用于收集和记录荧光信号，常见的荧光显微成像系统探测器包括光电倍增管、CCD相机和CMOS相机等。

其中，光电倍增管用于接收低强度的荧光信号，并通过电子放大将其转换为电信号；CCD相机和CMOS相机具有高灵敏度和分辨率，能够实时采集图像并记录。

1.样品台：样品台是放置生物样品的平台，通常由固定夹持装置和控制台组成。

固定夹持装置用于固定样品的位置，确保样品在成像过程中不移动或晃动。

控制台用于调节样品台的位置和倾角，以便选取最佳的成像角度。

2.激发系统：激发系统包括激发光源和筛片轮等组件，用于产生适当波长的激发光。

激发光源通常位于显微镜的下方或侧面，经由物镜进入样品。

筛片轮可根据需要选择不同的激发光波长，以过滤非目标光。

3.探测系统：探测系统包括物镜、滤光片和探测器等组件，用于收集和记录荧光信号。

物镜通过调节焦距和数值孔径，在样品上聚焦并收集荧光信号。

滤光片用于过滤非目标光，减少背景干扰。

一体化的光声-荧光显微镜用于活体肿瘤成像闫宝运;覃欢【摘要】报道了一种利用单一波长激发的同时产生光声和荧光信号的显微成像系统,本成像系统具有超高的成像分辨率(<6 μm).借助外源的造影剂在近红外的吸收特性,利用光声-荧光显微成像系统对活体肿瘤进行光声/荧光成像.实验结果表明,光声-荧光显微镜在早期肿瘤的成像和检测等方面具有潜在的应用价值.因此,通过研究和选择适当的双模态造影剂,该系统在不同病理模型中可以提供更准确的组织信息及生理参数.%A microscopy system utilizing a single wavelength excitation to produce both photoacoustic and fluorescence signals was reported.High imaging resolution (<6 μm) can be achieved.With the absorption characteristics of exogenous contrast agents in near infrared,in vivo tumor photoacoustic/fluorescence imaging was realized through this imaging system.The experimental results show that photoacoustic-fluorescence microscopy has potential application in early tumor imaging and detection.Therefore,by studying and selecting the appropriate dual modal contrast agent,more accurate tissue information and physiological parameters will be provided in different pathological models.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2017(026)003【总页数】5页(P212-216)【关键词】光声-荧光显微镜;活体肿瘤成像;造影剂【作者】闫宝运;覃欢【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州 510631;华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州 510631【正文语种】中文【中图分类】R318.51随着科学技术的发展，人们日益增长的物质生活文化水平的提高，也伴随各种各样的疾病的产生。

新型双光子显微成像系统生物医学应用探索一、新型双光子显微成像系统概述新型双光子显微成像技术是一种先进的生物医学成像技术，它利用双光子吸收过程来激发荧光，从而实现对生物样本的深层成像。

与传统的单光子成像技术相比，双光子显微成像技术具有更高的成像深度和更好的空间分辨率，这对于生物医学研究具有重要的意义。

1.1 新型双光子显微成像技术原理双光子显微成像技术基于双光子吸收现象，即一个荧光分子同时吸收两个低能量的光子，从而被激发到高能级状态。

这种现象通常发生在高斯激光束的焦点处，因此可以实现对生物样本的深层成像，同时减少光毒性和光漂白现象。

1.2 新型双光子显微成像技术的优势新型双光子显微成像技术具有以下优势：- 高成像深度：能够穿透生物样本数百微米，远超传统单光子成像技术。

- 高空间分辨率：由于双光子吸收过程的非线性特性，可以实现亚微米级别的空间分辨率。

- 减少光毒性：由于激发光的波长较长，对生物样本的光毒性较小。

- 减少光漂白：双光子吸收过程的非线性特性使得荧光分子的激发效率较低，从而减少光漂白现象。

1.3 新型双光子显微成像技术的应用领域新型双光子显微成像技术在生物医学领域有着广泛的应用，包括但不限于：- 神经科学研究：用于观察活体动物大脑中的神经网络活动。

- 细胞生物学研究：用于研究细胞内部结构和动态过程。

- 发育生物学研究：用于观察胚胎发育过程中的细胞迁移和分化。

- 病理学研究：用于研究疾病状态下的组织结构变化。

二、新型双光子显微成像系统的构建新型双光子显微成像系统的构建是一个复杂的过程，涉及到光学系统、电子系统、计算机系统等多个方面的设计和集成。

2.1 光学系统的构建光学系统是新型双光子显微成像系统的核心部分，包括激光器、扫描系统、物镜、检测系统等。

激光器提供双光子吸收所需的高能量光子，扫描系统控制激光束在样本上的扫描，物镜聚焦激光束并收集荧光信号，检测系统检测并转换荧光信号为电信号。

2.2 电子系统的构建电子系统负责控制光学系统的运行，并处理检测系统收集到的电信号。