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猪萨佩罗病毒VP1基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲
线的建立
刘熠凡;张静雯;王平利
【期刊名称】《河南畜牧兽医》
【年(卷),期】2024(45)3
【摘要】为建立用实时SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测PSVVP1基因表达量的标准曲线,试验根据目的基因在NCBI上CDS区的序列设计合成引物,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,采用real-time RT-PCR的检测方法,建立了检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线。
试验结果显示,线性回归系数为0.9981,且熔解曲线只有一个峰值,表明由VP1目的基因所建立的标准曲线线性关系良好。
试验成功建立了用SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线,为后续检测基因表达量的变化奠定了基础。
【总页数】4页(P7-9)
【作者】刘熠凡;张静雯;王平利
【作者单位】河南农业大学动物医学院
【正文语种】中文
【中图分类】S828
【相关文献】
1.猪Th1/Th2型细胞因子重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立
2.猪Th1／Th2型细胞因子重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立
3.猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的构建
4.猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步临床应用
5.猪萨佩罗病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
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猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征（英文PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种猪的高度接触性传染病，又称猪蓝耳病。
不同年龄、品种和性别的猪均可发生，但以妊娠母猪和仔猪是为常见。
该病以母猪发生流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、高死亡率等为主要特征，严重危害全球养猪业生产。
在2006年夏季，由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株引起的“高热综合征”在我国暴发，呈现高发病率和高病死率的特点，成为危害我国养猪业的新疫病之一，我国将其列为“高致病性猪蓝耳病”，列入一类动物疫病。
[流行病学]1．易感动物猪是唯一感染本病并出现症状的自然宿主，不同年龄的猪均可感染。
2．传染源感染猪和康复猪是本病的主要传染源。
感染猪常可导致长期的病毒血症/持续感染而排毒；即使在临诊症状消失后8周还可向外排毒，导致病毒在猪群中反复传播而难以根除。
3．传播途径本病主要经呼吸道、精液水平传播和生殖道垂直传播。
隐性感染猪引入猪群时，在应激状态下，会排出病毒，并通过多种途径如口、鼻、眼、粪便等感染其他易感猪只。
公猪通过精液在同猪群间水平传播PRRSV，怀孕母猪感染病毒后，经胎盘感染胎儿，造成繁殖障碍。
此外，某些禽（鸟）类带毒也是重要的传播媒介。
4．季节性本病的发生多呈明显的季节性，尤以寒冷季节多发。
[症状及病理变化]1．临诊症状本病潜伏期可因地域、季节的不同而长短不一。
本病的病程通常为3~4周，最长可达6~12周。
临诊症状在不同的感染猪群中有很大的差异。
（1）母猪发病初期，出现食欲不振，发热等，尤其妊娠后期较为严重。
少数母猪可见耳朵、腹部、腿部发绀。
母猪出现早产，产奶量了降，少部分早产猪四肢末端、尾、乳头、阴户和耳尖发绀。
其中以耳尖发绀最为常见。
妊娠晚期发生流产、产弱仔、死胎、木乃伊胎。
配种前感染的母猪产仔率降低、推迟发情、屡配不孕或不发情等。
（2）仔猪如在28日龄前感染，体温达40~41度，表现为严重呼吸道症状，如呼吸迫促、咳嗽、腹式呼吸及眼睑水肿，腹泻，耳尖至耳根皮肤发绀；病猪也可出现神经症状，如肌肉震颤、呆立、前肢呈八字脚，或运动失调、后躯麻痹。
猪繁殖与呼吸综合征的临床症状及治疗措施-养猪技术猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起猪的一种急性、高度传染性疫病，呈地方流行性。
猪繁殖与呼吸综合征病毒只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。
患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。
猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。
下面我们就一起来看看猪繁殖与呼吸综合征的临床症状及治疗措施。
1、临床症状急性型。
①母猪：是主要的受害猪群。
表现为精神不振、厌食、发热（40~41℃）、咳嗽，并有程度不同的呼吸困难。
部分母猪双耳、腹部及其外阴部皮肤出现一过性青紫色血斑，所以有人称该病为蓝耳病。
还有部分母猪出现肢体麻痹性神经症状。
妊娠后期发生早产、流产（流产率可达50%~70%）、死胎（可达35%）、木乃伊胎（可达25%）和产出弱仔猪。
流产胎儿多发生在妊娠后期，而后出现重复发情、受胎率低（受胎率可降低5%）。
②仔猪：以1月龄内的仔猪最易感，感染后症状明显。
早产的仔猪，在出生后当时或几天内死亡。
大多数初生仔猪表现为体温升高达40℃以上，精神不振，呼吸困难，眼睑水肿，肌肉震颤，共济失调，后肢麻痹，打喷嚏，嗜睡。
有的仔猪耳尖、耳边、四肢末端和腹侧皮肤发绀，死亡率高达80%~100%，而耐过的仔猪生长缓慢，易继发其他疾病。
③生长猪和肥育猪：对该病的易感性较低，感染后仅表现轻度的临床症状。
④种公猪：发病率较低，一般为2%~5%。
公猪感染后，主要表现为一般性临床症状，但公猪精液品质下降、精子活力降低，配种受胎率下降，精液可带毒，4周后才能逐渐恢复。
慢性型。
此为该病的主要形式。
主要表现为猪群的免疫功能下降，易继发感染其他细菌性和病毒性疾病；猪群的生产性能降低，生长缓慢；母猪群的繁殖性能下降。
猪群的呼吸道疾病（如传染性胸膜肺炎、附红细胞体病、支原体肺炎链球菌病等）发病率明显上升。
亚临床型。
2019年第10期 吉林畜牧兽医·现代农牧·XianDai NongMu猪流行性腹泻是猪养殖业常见的疾病之一，此病多发生于每年12月至翌年2月的寒冬季节，在夏季也可发病，由猪流行性腹泻病毒引起。
该病是一种接触性急性猪肠道传染病，以水样腹泻、呕吐和脱水为主要症状。
各种日龄的猪均易感，年龄越小死亡率高，其中哺乳仔猪受害最为严重。
该病70年代初首先发现于英国，我国从80年代初开始陆续有本病的报道，给养猪业造成了重大的经济损失。
所以及早确诊对于该病的诊治显得尤为重要，因此建立一种快速、高灵敏度的鉴别诊断PED的方法是十分必要的。
同常规PCR法相比，荧光定量PCR技术可靠性和特异性强，加之具有操作方便及耗时短等特点而广泛应用于多种传染病的诊断，如牛病毒性腹泻、猪瘟、禽流感、鸭瘟等的诊断。
本研究拟根据Genebank数据库序列设计特异性引物，建立一种灵敏稳定的针对猪流行性腹泻检测的定量PCR 方法，为猪流行性腹泻的快速诊断、检疫防疫及分子流行病学研究提供手段。
1 材料和方法1.1 实验材料猪流行性腹泻病毒分离自浙江某猪场腹泻病料；实验所需pMD18-T载体、胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。
以猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒作为特异性检测的对照。
荧光定量PCR试剂盒购于宝生物工程大连有限公司，ABI7300型荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司。
1.2 引物与探针设计根据GenBank上公布的猪流行性腹泻病毒的序列设计出上下游引物，扩增片段长度为186bp。
上游引物：5’-TACTAAGCGTAACATCCTGCC-3’；下游引物：5’-GTAGTACCAATAACAAC CGAAGC - 3’。
1.3 腹泻病料处理、病毒增殖、纯化和鉴定将腹泻粪便用PBS稀释10倍，离心20 min （4 000 rpm），取上清。
加氨苄青霉素和链霉素（200 U/mL），37 ℃放置2 h，-70 ℃保存备用。
Chinese Journai of Veterinaa Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第11期37猪捷申病毒TaqMan定量RT-PCR 检测方法的建立和初步应用秦毅斌1,苏乾莲1,赵硕2,卢冰霞1，何颖1,周展宏1,2,李斌1,1,2,赵武1（1.兽医研究所广西兽医生物重验室，530001；2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）摘要:为建立猪捷申病毒(PTV)的TaqMan实时荧光定量RT-CR(RT-qPCR)检测方法，在PTV基因组序列保守区设计引物和TaqMan,重组为阳性标准品，通过优化反应,了PTV的RT-qPCR方法，并进行特异性、感性和重复性试验。
结果表明，该方法仅对PTV出现特异性扩增反应，与猪流行性腹泻、猪状、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒等常见猪病毒均无交叉反应。
该方法的标准曲线Ct值与4.6x108~4.6x102拷贝/$L的质粒浓度范围具有良好线性关系，标准曲线方程为C=-3.201xlog?+40.527,线性相关系数(*)为0.996，检测下为4.6x 101拷贝多L对不同浓度的pMD18-PTV进行组内与组间重复检测，每个浓度重复试验的C值的变异系数均小于4.0%，好的重现性。
应所的方法对235份临床猪腹泻进行，PTV阳性32份，性为13.62%$本试验的RT-qPCR方法为PTV实验及研究分析提供了可靠的$关键词：猪捷申病毒；荧光定量RT-PCR;TaqMan探针中图分类号：S852.65T文献标志码：A文章编号：0529-6005(2020)11—0037—06Development and Preliminary Application of a Real-time TaqMan Fluorescent Quantitative RTPCR Assay for Detection of Porcine TeschovirucQU Yi-bin1，SU Qian-lian1，ZHAO Shuv2，LU Bing-xia1，HE Ying1，ZHOU Zhan-hong1，YUAN Ting-ting2，LI Bin1，DUAN Qun-peng1，OUYANG Kang2，ZHAO Wu1(1.Guangpi Veterinaa Research N s/NN，Guangxi Key Laboatoa of Veterinary Biotechnology，Nanning530001，China；2.Colleae of Anival Science and Technolog，Guangxi Universith，Nanning530005，China)Abstract:To establish a real-time TaqMan fuorescent quantitative RT-PCR(RT-qPCR)assay for the detection of porcine te-schovRus(PTV)，p/mem and TaqMan fluorescent probe were desianed according tr the conserved reaion of PTV genome sequence.A recombinant plasmid was constructed as the positive standard sample，and RT-qPCR was developed by optimization of reacting conditions./urthermoro，the specificity，sensitivity and repeatabilith of the established RT-qPCR were tested.Results showed that there was no cross-reaction with conventionai porcine viruses，such as porcine epidemic diarrhea virus，porcine tansmissible gastroenteritis，porcine deeacoanavRus，porcine rotavirus group A，and et ai.The assay was lineas for the template plasmin pMD18-TTV in the range from4.6x108copies/$L te4.6x102copies/$L，the standard equation was C=-3.201x log?+40.527，coeelation coefficient was*=0.996，and detection limit was low te4.6x101copies/$L.Also，the assay showed the good reproducibility with the coefficient of variation(CV)less than4%both in intra-5ssay and inter-5ssay.ThRty-two of the235clinicai fecai samples collected from dVferent areas in Guangi were positive for PTV tested by the developed assay.In conclusion，the development of this assay provides a convenient，specific and sensitive diagnostic method for the PTV detection and epidemiologicai investigation.Key words:porcine teschovRus；real-Cme TaqMan Iuorescent quantitative PCR；TaqMan Iuorescenco probeCorressonding author：ZHAO Wu，E-maii:zhaowul68866@收稿日期：2020—05—10基金项目:广西创新驱动发展专项资金项目（桂科AA17204057）；广西基本科研业务费专项（桂科专项202/19-2）；广西自然科学基金项目（2017GXNSFBA198092）；广西兽医生物技术重点实雌开放基金课题（16A?0A5氨A/17A59A6氨A）；广西柳州市科技计划（2018BH20501）作者简介:秦毅斌（1983-）,男，高级兽医师，硕士，研究方向为动物传染病病原与分子生物学,E-mel：qmymm51??@163•com通讯作者:赵武,E-maii:zhaowu168866@163-com38中国兽医杂志2020年(第56卷)第11期Chinese Journai of Veterinao Medicine猪捷申病(Porcina teschen disease,PTD)，又称塔尔凡病或脑脊髓炎，是由猪捷申病毒(Porcine tv-schovirus,PTV)感染引起的一种猪病毒性传染病$该病首次于1929年在捷克斯洛伐克的捷申地区发现，故命名为“捷申病”，随后传播至北美%非洲、澳大利亚和日本等国家，目前已散布于世界各养猪国家(1猪群感染PTV后，主要表现为腹泻、脑脊髓灰质炎⑵、肺炎、心包炎、心肌炎、皮肤损坏等症状,母猪还可导致繁殖障碍［3］,感染发病猪具有较高的病死率,给养猪业带来了较大经济损失$PTV属于小RNA病毒科(PRomavibdae)捷申病毒属(Teschovirus)成员，病毒粒子呈球形,外层包裹衣壳，无脂蛋白，病毒基因组为单股正链RNA,长约7.2kb,仅含有1个完整的编码1个多聚蛋白的开放阅读框!0RF)，该多聚蛋白被蛋白水解酶裂解为非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D和结构蛋白L、VP1、VP2、VP3%VP4(45)$PTV至少有11个血清型［6］,并且还不断出现新的血清型PTV12(7)、PTV13［8］$研究表明，我国猪群PTV感染较为普遍。
猪繁殖与呼吸综合征研究进展猪繁殖与呼吸综合征是一种由高致病力的冠状病毒引起的猪类疾病，主要特点是高度致病性、迅速传播、临床症状严重。
近年来，随着对猪繁殖与呼吸综合征的研究不断深入，人们对该疾病的病原学、发病机制、流行病学等方面有了更为深入的了解。
本文将综述猪繁殖与呼吸综合征研究的进展。
首先，猪繁殖与呼吸综合征的病原学研究取得了重要进展。
通过病毒分离、基因序列分析等方法，已将该疾病的病原鉴定为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。
分子流行病学研究发现，PRRSV至少存在两个主要亚群，即欧洲亚群和美洲亚群，且存在较高的遗传变异率。
近年来，病毒亚群之间的基因重组事件越来越频繁，使得疫苗的设计与开发面临更大的挑战。
其次，在病原传播途径方面的研究也取得了一定进展。
猪繁殖与呼吸综合征主要通过两种方式传播，即直接接触和通过空气传播。
病毒在病猪体内主要定殖在单核细胞系，但也可通过唾液、粪便和尿液等分泌物和排泄物进行传播。
此外，病毒在猪场内环境中的存活时间较长，使得传播风险更高。
因此，加强猪场内环境卫生管理对于控制疾病传播具有重要意义。
最后，针对猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制研究也在不断深入。
目前，该病的主要控制措施包括疫苗接种、生物安全措施和药物治疗等。
疫苗接种是目前预防猪繁殖与呼吸综合征的主要手段，但由于病毒变异率高，疫苗的保护效果存在一定局限性。
因此，研发针对该疾病不同亚群的疫苗仍然是当前的研究重点。
此外，加强生物安全措施，如限制人员流动、加强检疫和消毒工作，有效地控制了疾病的传播。
还有一些研究表明，采用抗病毒药物对病猪进行治疗也可以取得一定的效果，这对于控制疾病的严重程度具有一定的意义。
总之，随着对猪繁殖与呼吸综合征研究的不断深入，人们对该疾病的病原学、传播途径、预防和控制等方面有了更全面的认识。
然而，由于该疾病的病原特性和环境因素的影响，对其完全控制仍存在挑战。
因此，需要进一步加强对猪繁殖与呼吸综合征的研究，以期能够开发出更有效的防控措施，为猪产业的健康发展提供保障。
5种猪病多重PCR检测方法的建立王隆柏;张志刚;苏永裕;车勇良;吴学敏;周伦江【摘要】为建立猪群常见疫病多重PCR诊断方法,本研究据GenBank发表的猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)基因序列,设计并合成了5对特异性引物.通过反应条件优化、特异性、敏感性和重复性测定,建立了能同时扩增CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV5种病毒的多重PCR方法.结果表明该方法只能检测出CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV 5种病毒,不能检测出猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)、猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、猪链球菌(Streptococcus suis,SS)和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),能检测到CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV的核酸浓度分别为220、1.6、72、400和370 pg.初步应用结果表明,建立的多重PCR方法适用于对CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV的快速诊断.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(041)002【总页数】5页(P21-25)【关键词】猪瘟病毒;猪繁殖与呼吸综合征病毒;猪伪狂犬病病毒;猪圆环病毒2型;猪细小病毒;多重PCR;建立【作者】王隆柏;张志刚;苏永裕;车勇良;吴学敏;周伦江【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;肉食品安全生产技术国家重点实验室,福建厦门 361100;肉食品安全生产技术国家重点实验室,福建厦门 361100;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013【正文语种】中文【中图分类】S852.65近年来，随着中国养猪业规模化、集约化蓬勃发展，猪病的发生和流行对养猪生产的危害日趋加重，且多病原混合感染已成为当前猪群疫病流行的主要形式与特点（陈焕春，2011）。
