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RNAi的实验设计及使⽤步骤RNAi的实验设计及使⽤步骤RNA ⼲扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的⼴泛存在于⽣物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之⼀的，dsRNA 特异性的核酸酶Dicer 将dsRNA 裂解成由21-25 个核苷酸组成的⼩⼲扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA 作为介导⼦引起特异性地降解相同序列的mRNA，从⽽阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
siRNA 设计A.哺乳动物siRNA 设计基因抑制的有效性很⼤程度取决于⽬的基因序列的选择。
⽬的序列可以随机选择也可以通过在⽬的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。
哺乳动物siRNA设计需要注意的⼏个⽅⾯1．从转录本（mRNA）的AUG 起始密码开始，寻找“AA”⼆连序列，并记下其3'端的19 个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点。
正义链和反义链都采⽤这19 个碱基(不包括AA 重复)来设计。
2．避免在起始密码⼦或⽆义区域附近选择⽬的序列。
3．siRNA 序列的GC 含量应为30%-60%左右。
4．在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的⾮编码区（untranslatedregions，UTRs），原因是这些地⽅有丰富的调控蛋⽩结合区域，⽽这些UTR 结合蛋⽩或者翻译起始复合物可能会影响siRNA 核酸内切酶复合物结合mRNA 从⽽影响siRNA 的效果。
5．将挑选的序列在公共数据库中进⾏⽐较以确保⽬的序列与其它基因没有同源性。
将潜在的序列和相应的基因组数据库（⼈，或者⼩⿏，⼤⿏等等）进⾏⽐较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使⽤BLAST （/doc/e0a96be6591b6bd97f192279168884868662b862.html /BLAST/）。
水稻RS6基因反义表达载体的构建及遗传转化1999级生物技术专业 苏英华指 导 教 师: 张宪省 教授李兴国 副教授摘要：本实验旨在利用反义RNA技术对水稻种子特异基因RS6进行功能分析。
首先以RT-PCR技术克隆到RS6特异片段，然后将此特异片段反向插入表达载体Ubiquitin-1301中，构建起RS6反义表达载体Ubiquitin-1301-RS6。
利用农杆菌介导的方法转化水稻（Oryza sativa L.）的胚性愈伤组织。
通过抗性筛选，以期获得转基因植株，并通过对转基因植株的表型分析，确定RS6的功能。
目前已获得部分抗性愈伤组织。
关键词：水稻；反义RNA；表达载体；遗传转化Construction of expression vector with anti-RS6 and Agrobacterium-mediated transformation of rice (Oryza sativa L.)Biotechnology, 1999Ying hua SuDirectors:Xian sheng Zhang professorXing guo Li adjunct professor Abstract: The function of RS6, a gene expressed preferentially in rice（Oryza sativa L.）seed was characterized by antisense RNA technology. 3’ UTR of RS6 gene was cloned with RT-PCR and the antisense sequence was inserted into the Ubiquitin-1301 expression vector. The vector with antisense specific fragment of RS6 was constructed and named Ubiquitin-RS6. The antisense construct of RS6 was then introduced into rice (Oryza sativa cv. Zhong Hua 11) calli by means of an Agrobacterium-mediated transformation. According to the phenotype of transgenic plants, we can characterize its biological function. So far, we have got the transgenic calli successfully.Key words: Oryza sativa L.; antisense RNA; expression vector; transformation1.引言水稻是基因组较小的单子叶植物，也是第一大粮食作物，且已建立成熟的遗传转化系统，是研究禾本科作物以及单子叶植物发育、遗传和分子生物学的模式植物。
姓名：乔艳红学号：**********年级：2010级班级：一班学院：生命科学学院时间：2011年11月9日核酶的发现与应用一、核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
核酶的发现在生命科学中具有重要意义，在进化上使我们有理由推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者是一体的，只是在进化的某一进程中蛋白质和核酸分别执行不同的功能。
核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手段，具有重要的应用前景。
二、核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。
核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。
核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DNA, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
U pA G pU 5'3'5'外显子3'外显子内含子三、核酶的分类剪接型（ splicing ）核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
反义寡核苷酸序列反义寡核苷酸序列指的是一种与原始DNA或RNA序列有相反碱基配对的寡核苷酸序列。
在这种反义序列中，腺嘌呤（A）被胸腺嘧啶（T）取代，而胸腺嘧啶（T）则被腺嘌呤（A）取代；鸟嘌呤（G）被胞嘧啶（C）取代，而胞嘧啶（C）则被鸟嘌呤（G）取代。
反义寡核苷酸序列对于生物学和分子生物学领域具有重要意义。
其主要作用是在实验室中研究DNA和RNA的结构和功能，以及相关的分子机制。
在以下的几个方面我们可以看到反义寡核苷酸序列的应用。
1.基因工程：反义寡核苷酸序列可以通过DNA合成技术用于基因的修饰和重组。
通过引入反义寡核苷酸序列，可以修改目标基因的序列，并改变编码的蛋白质的氨基酸序列。
这种技术可以用来研究蛋白质的结构和功能。
2.基因表达调控：反义寡核苷酸序列可以用于基因表达的调控。
通过引入与目标基因相反的序列，可以抑制目标基因的表达。
这种技术被广泛应用于基因沉默（gene silencing），研究基因功能和调控机制。
3. RNA干扰：反义寡核苷酸序列也可以用于RNA干扰（RNA interference）。
这是一种通过引入小分子RNA序列来沉默目标基因的技术。
反义寡核苷酸序列可以与目标RNA序列互补配对，并引起RNA 降解或抑制翻译过程，从而抑制目标基因的表达。
4.抗病毒治疗：反义寡核苷酸序列可以用于抗病毒治疗。
病毒的基因组是RNA，通过设计与病毒基因组相反的寡核苷酸序列，可以特异性地结合病毒RNA，并阻断病毒蛋白质的合成和病毒复制过程，从而实现抗病毒治疗的效果。
总结起来，反义寡核苷酸序列在生物学和分子生物学领域具有广泛的应用。
通过对基因序列的修饰和调控，它们可以用来研究基因功能和调控机制。
在抗病毒治疗和基因沉默等方面，反义寡核苷酸序列也有着重要的应用潜力。
在未来的研究中，我们可以期待更多关于反义寡核苷酸序列的应用和发展。
吉玛公司提供的siRNA是双链的还是单链的？吉玛公司的siRNA是双链的,而且也是按照双链来定价的。
吉玛公司RNA寡核苷酸使用什么纯化方法？吉玛公司运用国际上通用的HPLC纯化，如果特殊需要可以进行PAGE纯化。
合成RNA寡核苷酸的最大长度是多少？目前RNA寡核苷酸的最大长度是40碱基。
我们需要提供什么信息用于siRNA的合成？你们可以帮助免费设计吗？您需要准确地提供siRNA的19个核苷酸的靶序列和悬垂的合成物，或者您也可以提供相应地基因的GeneID 或者Accession Number，由我们公司技术人员为您免费设计。
如何选择siRNA的悬垂组成？悬垂的序列组成是由顾客自行选择的。
最近研究表明悬垂的组成在mRNA靶识别和酶解中不是很重要。
悬垂可能在形成RISC的过程中起结构的作用。
很多研究人员选择dTdT是因为研究表明脱氧核糖核苷能保护siRNA免受酶解。
合成序列最重要的是确定靶mRNA的19个碱基的核心结构。
针对人体基因设计的siRNA对其他物种是否也有效？一般siRNA都具有物种特异性，很少与其他物种有相同的靶位点，所以针对人体基因设计的siRNA不会沉默其他物种的同源序列。
然而，也有研究表明siRNA经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效，这需要仔细进行siRNA设计和生物信息学分析。
你们提供的siRNA是怎样装运的？如果在常温下放置了一个星期，还有效吗？吉玛公司为您提供的siRNA是冻干粉包装的，在常温下运输。
这些冻干的样品在室温下能稳定保存2－4个星期，所以放置一个星期不会影响其沉默效果。
但我们建议您收到样品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷冻箱中。
在体外实验中，需要多少量的siRNA？我们建议您用于实验的siRNA的浓度为100nM。
1nmol siRNA的量对于一个24孔板或是96孔板的实验已经足够了。
用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率，我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗？增加siRNA的浓度一般不能改进沉默效率。
反义核苷酸名词解释药物化学
反义核苷酸是一种药物化学领域的研究对象，它是一类具有特殊生物学活性的小分子化合物。
反义核苷酸药物通过与靶细胞内的核酸分子相互作用，干扰病原体的基因表达或功能，从而达到治疗疾病的目的。
反义核苷酸药物的主要作用机制有以下几种：
1.互补配对：反义核苷酸与靶细胞内的互补核酸序列相互结合，形成双链核酸，阻止靶基因的转录和翻译过程。
2.核酸酶切割：反义核苷酸与靶核酸结合后，可引导核酸酶切割靶核酸分子，从而降解病原体的基因信息。
3.免疫刺激：部分反义核苷酸具有免疫刺激作用，可促使机体产生免疫应答，对抗病原体。
4.输送药物：反义核苷酸可作为载体，将其他药物运输至靶细胞内，提高药物的生物利用度和治疗效果。
在药物化学领域，反义核苷酸药物的研究具有重要意义。
由于许多疾病（如先天遗传性疾病）无法通过传统小分子药物和蛋白类药物治疗，反义核苷酸药物成为了一个潜在的治疗选择。
此外，反义核苷酸药物具有高度特异性，可针对特定基因进行精准治疗，降低副作用。
目前，反义核苷酸药物已在多个疾病领域开展临床试验，如肿瘤、神经系统疾病、心血管疾病等。
.第二章核酸杂交技术（一）名词解释1．原位杂交2．核酸分子杂交技术3．探针4．反向点杂交5．缺口平移标记法6．随机引物标记法7．末端标记法8．Southern blot杂交9．荧光原位杂交10．菌落杂交（二）选择题【A型题】1．DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（）A G－C含量B A－T含量C A－G含量D A－C含量E T－G含量2．液相杂交是下列哪一种（）A Southem印迹杂交B Northem印迹杂交C Dot印迹杂交D Slot印迹杂交E RPA实验3．研究得最早的核酸分子杂交种类是（）A 菌落杂交B Southern杂交C Northern杂交D 液相杂交E 原位杂交4．Southern杂交通常是指（）A DNA和RNA杂交B DNA和DNA杂交C RNA和RNA杂交D 蛋白质和蛋白质杂交E DNA和蛋白质杂交5．最容易降解的核酸探针是( )A cDNA探针B dsDNA探针C ssDNA探针D gDNA探针E: RNA6．探针基因芯片技术的本质就是（）A 核酸分子杂交技术B 蛋白质分子杂交技术C 聚合酶链反应技术D 基因重组技术E 酶切技术7．DNA探针的长度通常为( )A 1000 ～ 2000个碱基B 500 ～ 1000个碱基C 400 ～ 500个碱基D 100 ～ 400个碱基E. <100个碱基8．寡核苷酸探针的最大的优势是（）A 杂化分子稳定B 可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列C 易标记D 易合成E 易分解9．在Southern印迹中常用的核酸变性剂是( ) A 甲醛B 乙醛C 氢氧化钠D 碳酸钠E 盐酸10．盐酸硝酸纤维素膜最大的优点是（）A 脆性大B 本底低C 共价键结合D 非共价键结合E 高结合力11．最常用的DNA探针标记方法是( )A 随机引物B 切口平移C 3′ -末端标记D 5′ -末端标记E PCR法12．为了除去探针，重复使用滤膜，以下哪种情况不可以发生（）A 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经干燥过B 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经湿润过C 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经温浴过D 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经漂洗过E 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经标记过13．5′一末端的DNA探针标记主要依靠的酶是( )A T4多聚核苷酸激酶B 末端转移酶C AKPD DNA polⅡE DNA pol14．血友病是一种（）A 染色体病B X连锁遗传病C 先天性代谢缺陷病D 先天畸形E 常染色体隠性遗传病15．预杂交中最常用的封闭剂是( )A Denhavdt's溶液B 5×TBEC 1×TBED 1×TAEE 1×TPE16．检测目标是RNA的技术是（）A Southern杂交B Western杂交C Northern杂交D Eastern杂交E 杂交淋巴瘤17．检测靶序列是DNA的技术是（）A Southern杂交B Western杂交C Northern杂交D Eastern杂交E 杂交淋巴瘤18．DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA 分子成为单链，这一过程称（）A 变性B 复性C 复杂性D 杂交E 探针19．具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称（）A 变性B 复性C 复杂性D 杂交E 探针20．一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称（）A 变性B 复性C 复杂性D 杂交E 探针21．点/狭缝杂交可以用于（）A 快速确定是否存在目的基因B 不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C 用于基因定位分析D 阳性菌落的筛选E 蛋白水平的检测22．放射自显影时反射光产生的潜影在低温下较稳定，最适温度是( )A -70℃B -30℃C -20℃D -10℃E 4℃23．Southern印迹杂交可以用于（）A 不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息B 检测的目标是RNAC 用于基因定位分析D 阳性菌落的筛选E 蛋白水平的检测24．寡核苷酸探针的Tm简单计算公式为( )A Tm=4(G+C)+2(A+T)B Tm=2(G+C)+4(A+T)C Tm=6(G+C)+4(A+T)D Tm=2(G+C)+6(A+T)E Tm=6(G+C)+2(A+T)25．Northern印迹杂交可以用于（）A 快速确定是否存在目的基因B 不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C 检测的目标是RNAD 用于基因定位分析E 阳性菌落的筛选2626．荧光原位杂交可以用于（）A 快速确定是否存在目的基因B 检测的目标是RNAC 用于基因定位分析D 阳性菌落的筛选E 蛋白水平的检测27．以等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时，若能与突变探针及正常探针接合，则该样本为（）A 正常人B 杂合体患者C 纯合体患者D 携带者E 不能确定28．在pH为下述何种范围时，Tm值变化不明显( )A pH为3～5B pH为4～5C pH为5～6D pH为5～9E pH为8～1129．一般来说，设计的寡核苷酸探针的长度为（）A 2-10bpB 17-50bpC 60-100bpD 100-200bpE 200-300bp30．变性剂可使核酸的Tm值降低，常用的变性剂是( )A 甲酰胺B 氢氧化钠C 浓盐酸D 稀盐酸E 甲醇31．下列有关cDNA探针的描述不正确的为（）A 利用mRNA通过RT-PCR在体外反转录可制备大量的cDNA探针B cDNA探针不包含内含子C cDNA探针不包含大量的高度重复序列D 由于cDNA探针自身所携带的poly（dT），有可能产生非特异性杂交的问题E cDNA探针合成方便，成为探针的重要来源32．一般来说核酸杂交的温度低于其Tm值的多少度进行( )A 15～25℃B 10～15℃C 5～10℃D 30～40℃E 40～50℃33．对于寡核苷酸探针，杂交温度一般般低于其Tm 值( )A 30～40℃B 20～30℃C 15～30℃D 10～15℃E 5℃34．一般情况下，不含变性剂甲酰胺时，杂交反应常在多少℃下进行( )A 90B 80C 75D 68E 5835．在含50%甲酰胺时，杂交反应在多少℃进行( )A 70B 65C 55D 42E 3536．杂交时的温度与错配率有关，错配率每增加1%，则Tm值下降( )A 0.5℃B 1～1.5℃C 2～2.5℃D 3～3. S℃E 4～4.5℃37．RNA/RNA的杂交体的Tm值一般应增加( )A 1～5℃B 5～10℃C 10～15℃D 15～20℃E 20～25℃38．杂交的时间一般为Cot1/2的( )A l倍B 1～3倍C 3 ～5倍D 5～8倍E 10倍以上39．为封闭非特异性杂交位点，可在预杂交液中加入( )A ssDNAB 1×SSCC 10×SSCD 5×TBECE 50×TAE40．随机引物法标记探针常用的A、G、C、T聚合体的数目是( )A 4个B 6个C 8个D 10个E 12个【X型题】41．下列哪些是影响DNA复性的因素( )A DNA浓度B DNA的分子量C 温度D 碱基组成E DNA的来源42． DNA探针的优点有（）A 制备方法简单B DNA探针易降解C DNA探针的标记方法成熟，有多种方法可以选择D 克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽E 单链，不存在竞争性的自身复性43．以下哪些方法可以用于探针的全程标记（）A DNA加尾法B DNA切口平移标记法C 随机引物标记法D 末端标记E 尾端标记44．关于DNA变性的描述正确的是( )A 二级结构破B 一级结构破坏C 黏度降低D 生物活性丧失E 浮力密度增加45．以下哪些因素可以使DNA变性（）A 增加溶液的浓度B 加热C 改变溶液的pH值D 有机溶剂E 冷藏46．预杂交中，下列能起封闭作用的是( )A ssDNAB BSAC 小牛胸腺DNAD 脱脂奶粉E DTT47．变性的DNA会发生哪些理化性质的变化（）A 粘度下降B 沉降速度增加C 浮力下降D 紫外光吸收增加E 紫外光吸收减少48.下列物质适于非放射性探针标记的是( )A AKPB ACPC 生物素D 地高辛E 荧光素49．关于人工合成的寡核苷酸探针，下列描述正确的是( )A 特异性高B 可依赖氨基酸序列推测其序列C 分子量小D 可用于相似基因顺序差异性分析E 可用末端转移酶进行5′端标记50．通过哪些措施可以提高杂交反应的速度（）A 采用大片段探针B 少量的反应体积C 高反应温度D 不断的振摇E 大量的反应体积51．关于切口平移法下述正确的是( )A 可标记线性DNAB 可标记松散螺旋DNAC 可标记超螺旋DNAD 可标记存在缺口的双链DNAE 可标记随机引物52．以下哪些方法可以用于从凝胶上转移DNA（）A 毛细转移B 真空转移C 负压转移D 电泳转移E 冷冻转移53．关于随机引物法标记探针下述正确的是( )A 可标记单链DNAB 可标记双链RNAC 可标记单链RNAD 比活性高达108cpm／µg DNA以上E 常经过SephadexG-50纯化才可使用54．可以采用哪些方法来标记探针（）A 杂交标记法B 切口平移标记法C 5’-末端的标记D 3’-末端的标记E 化学法延长标记55．整个杂交反应主要以下哪些步骤组成（）A 预杂交B 杂交C 洗脱D 固定E 转移56．放射自显影可以被分为（）A 直接放射自显影B 氧化显影C 封闭显影D 间接放射自显影E 固定显影57．关于电转移下列描述正确的是( )A 快速、高效B 需要特殊设备C 缓冲液用TAE或TBED 可产生高温E 常用NC膜作为支持介质58．预杂交的主要目的是（）A 平衡滤膜B 封闭非特异性杂交的位置C 提高杂交信号的检测效率D 便于从滤膜上除去探针E 清除用于杂交反应检测的显色物质59.关于非放射性探针标记，下列描述正确的是( )A 对人体危害小B 需要特殊设备C 可长时间使用D 灵敏度不如放射性探针E 重新杂交新探比较容易60．对于改变DNA片段长度的突变，可以由于缺失或插入产生，或由于限制性酶切位点改变而导致限制性片段长度改变。
反义寡核苷酸（aso）实验方法反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）是一种具有反向互补碱基序列的寡聚核苷酸序列。
反义寡核苷酸通过与目标RNA 的特定区域序列互补结合，阻断RNA的转录、剪接、翻译或稳定性，从而通过抑制特定基因的表达来实现治疗目的。
在研究领域中，反义寡核苷酸也被广泛用于研究基因功能、疾病发生机制以及药物开发等方面。
实验方法：一、设计反义寡核苷酸序列设计反义寡核苷酸序列是使用反义寡核苷酸进行研究的第一步。
首先，需要选择目标基因的靶点序列。
最常见的靶点是靶向mRNA的编码区域，因为这对于阻断目标基因的蛋白质合成具有最高的效率。
接下来，需要通过一系列计算和筛选程序，选择反义寡核苷酸序列。
设计时需要考虑反义寡核苷酸的长度、GC含量、碱基组成和互补性等因素。
最有效的反义寡核苷酸序列应该具有高亲和力和特异性，同时应避免与非目标RNA序列的配对。
二、合成反义寡核苷酸合成反义寡核苷酸是实验的下一步。
反义寡核苷酸可以通过化学合成方法合成。
合成方法通常采用固相合成技术，其中核苷酸分子通过添加保护基和活性基团的方法，逐个添加到固相载体上。
合成出的反义寡核苷酸需要进行纯化和鉴定，以确保其合成质量和纯度。
三、体外细胞实验在体外细胞实验中，需要将反义寡核苷酸转染到目标细胞中。
转染方法包括化学转染、电转染和病毒载体介导转染等。
转染后，反义寡核苷酸被细胞摄取，并与目标RNA互补结合。
这种结合可以通过碱基配对识别机制实现，从而形成反义寡核苷酸与mRNA的双链结构。
双链结构的形成抑制了mRNA的翻译或通过RNA酶降解机制降解mRNA。
实验人员可以通过多种实验方法，如PCR、Western blot和细胞荧光染色等，验证目标基因的表达是否被抑制。
四、动物模型实验在动物模型中进行反义寡核苷酸的实验需要将合成的反义寡核苷酸注射到动物体内。
这可以通过不同的途径实现，如静脉注射、肌肉注射和腹腔注射等。
