反义核苷酸技术
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水稻RS6基因反义表达载体的构建及遗传转化1999级生物技术专业 苏英华指 导 教 师: 张宪省 教授李兴国 副教授摘要:本实验旨在利用反义RNA技术对水稻种子特异基因RS6进行功能分析。
首先以RT-PCR技术克隆到RS6特异片段,然后将此特异片段反向插入表达载体Ubiquitin-1301中,构建起RS6反义表达载体Ubiquitin-1301-RS6。
利用农杆菌介导的方法转化水稻(Oryza sativa L.)的胚性愈伤组织。
通过抗性筛选,以期获得转基因植株,并通过对转基因植株的表型分析,确定RS6的功能。
目前已获得部分抗性愈伤组织。
关键词:水稻;反义RNA;表达载体;遗传转化Construction of expression vector with anti-RS6 and Agrobacterium-mediated transformation of rice (Oryza sativa L.)Biotechnology, 1999Ying hua SuDirectors:Xian sheng Zhang professorXing guo Li adjunct professor Abstract: The function of RS6, a gene expressed preferentially in rice(Oryza sativa L.)seed was characterized by antisense RNA technology. 3’ UTR of RS6 gene was cloned with RT-PCR and the antisense sequence was inserted into the Ubiquitin-1301 expression vector. The vector with antisense specific fragment of RS6 was constructed and named Ubiquitin-RS6. The antisense construct of RS6 was then introduced into rice (Oryza sativa cv. Zhong Hua 11) calli by means of an Agrobacterium-mediated transformation. According to the phenotype of transgenic plants, we can characterize its biological function. So far, we have got the transgenic calli successfully.Key words: Oryza sativa L.; antisense RNA; expression vector; transformation1.引言水稻是基因组较小的单子叶植物,也是第一大粮食作物,且已建立成熟的遗传转化系统,是研究禾本科作物以及单子叶植物发育、遗传和分子生物学的模式植物。
吗啉反义寡核苷酸在基因功能研究中的应用何萌萌;薛良义【摘要】吗啉反义寡核苷酸属于第三代反义寡核苷酸,主要通过阻断mRNA的剪接过程来抑制目的基因的功能.吗啉反义寡核苷酸技术现已广泛应用于发育过程中基因功能的研究;鉴于吗啉反义寡核苷酸能与病毒特异mRNA结合,形成的双链物可有效阻断病毒RNA的转录,从而抑制病毒的复制,所以该技术已应用于医学研究,如治疗病毒感染、癌症、肌营养不良症和早老综合症等疾病.主要阐述了吗啉反义寡核苷酸的结构特点、作用机制、与其它反义技术的比较,以及该技术的应用与展望.%Phosphorodiamidate morpholino oligomers are belong to the third generation of antisense oligonucleotides, and can inhibit the function of the target gene mainly by blocking mRNA splicing. Morpholino antisense oligonucleotide technology was widely used in the research of gene function during developmental process. The phosphorodiamidate morpholino oligomers and the specific viral mRNA can form the double-stranded material, which effectively block the transcription of viral RNA, and therefore inhibit the viral replication. So this technology is also used in the medical research such as treating viral infections, cancer, muscle nutrition dysplasia syndrome and Alzheimer disease. This article focused on the structure and functional mechanism of phosphorodiamidate morpholino oligomers, comparison with other antisense technologies, the applications and prospects of the technology.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2012(029)006【总页数】4页(P77-79,83)【关键词】吗啉反义寡核苷酸;基因功能;应用【作者】何萌萌;薛良义【作者单位】宁波大学海洋学院,宁波315211;宁波大学海洋学院,宁波315211【正文语种】中文【中图分类】Q524吗啉反义寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligomers,即PMO)因其核苷酸骨架上的吗啉环而得名,吗啉环取代了RNA中的核糖核苷酸环或者DNA中的脱氧核糖核苷酸环[1]。
反义核酸药物大家一定都没听说过反义核酸药物,反义核酸药物是一种平常人很难会接触到的药物。
下面是店铺为你整理的反义核酸药物的相关内容,希望对你有用!反义核酸药物的作用原理反义核酸目前有三种来源:一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides,AON),这是反义核酸最普遍的应用方式,包括未修饰AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修饰AON二类,其中以PSAON应用最广泛。
ANO设计合成简单,只要其顺序与靶mRNA部分顺序互补即可,而对基因的读码框无要求;二是更具有实用价值的人工表达载体,包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体[3],它是利用基因重组技术将靶基因序列反向插入到载体的启动子和终止子之间,通过转录可源源不断产生反义RNA分子;三是天然存在的反义核酸分子,但目前分离纯化尚存在困难。
反义核酸药物的作用特点反义核酸作为基因治疗药物之一,与传统药物相比具有诸多优点。
1)高度特异性:反义核酸药物通过特异的碱基互补配对作用于靶RNA或DNA,犹如“生物导弹”。
2)高生物活性、丰富的信息量;反义核酸是一种携带特定遗传信息的信息体,碱基排列顺序可千变万化,不可穷尽。
3)高效性:直接阻止疾病基因的转录和翻译。
4)最优化的药物设计:反义核酸技术从本质上是应用基因的天然顺序信息,实际上是最合理的药物设计。
5)低毒、安全:反义核酸尚未发现其有显著毒性,尽管其在生物体内的存留时间有长有短,但最终都将被降解消除,这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。
反义核酸药物的在寄生虫学中的应用反义核酸技术的飞速发展和成熟,使其逐渐渗透并应用到寄生虫学领域,丰富和发展了寄生虫病的基因治疗策略。
反义核酸技术在抗寄生虫病研究的应用主要集中于原虫类,如疟原虫、锥虫和利什曼原虫等,而且反义核酸中又以AON方面的报道最多。
下面着重就AON 在寄生虫方面的研究应用作用一简要阐述。
肿瘤防治研究2002年第 卷第3期 反义核酸技术在肿瘤治疗中的应用 柄涛,昊家林,成蓥
关键词:反义核酸技术;肿瘤治疗;特异性;进展 中图分类号:R730.5 文献标识码:A 文章编号:i000—8578(2002)03 0255 02
反义桉酸技术作为一种新的分子生物学工具及新 型药物,它的应用受到越来越多的重视。在抗肿瘤应 用方面,反义桉酸药物可以特异性的抑制癌基因的异 常表达或者抑制肿瘤细胞特异蛋白质的表达,诱导肿 瘤细胞发生凋亡,使肿瘤消退或彻底消失 ]。在抗病 原微生物感染方面针对病原微生物的特异基因的反义 桉酸可较好地阻止其对人体的伤害。本文就反义核酸 技术在肿瘤治疗研究中应用方面的新进展作一综述。 1反义核酸技术的基本原理 反义桉酸技术就是根据碱基互补原理,利用人工 或生物台成特异互补的DNA或RNA片段抑制或封 闭基因表达的技术,包括反义寡核苷酸技术、反义 RNA技术和核酶技术。 反义寡核苷酸(antisense oligonue!eofides,AsON) 技术,就是用一段人工台成的能与RNA或DNA互补 结台的寡核苷酸链抑制基因的表达。该技术作用原理 是:①ASON与DNA结台,抑制DNA复制和转录,② ASON与mRNA前体结台,阻断RNA加工、成熟,影 响核糖体结沿rr ̄NA移动,激活RNase,剪切杂交链 中未配对的碱基。 反义RNA技术指利用基因重组技术,构建人工表 达载体,使其离体或体内表达反义RNA,从而抑制靶 基因的表达。其作用原理有以下几个方面:①与前 mR_NA结台,影响mRNA的成熟和在胞浆内的转运, ②与相应的靶RNA结台从而激活RNase,加速靶 RNA的降解,③直接与起始密码子AUG互补结台而 阻止转录的启动,④互补作用于SD编码区的反义 KNA可阻止核糖体在mRNA上的移动。 核酶(ribozyme)是一类具有酶活性的RNA分子,可 以自我催化和切割,并且这种作用元需能量,它的作用 可使RNA被降解而无法进行转录和翻译。核酶技术是 利用这类具有催化活性的特殊的反义RNA,可与靶序列 杂交并加以剪切,从而对基因表达进行调控。核酶的基 因组成分两部分;中间的极为保守的桉苷酸序列(活性 中心)和两端的引导序列,引导序列与靶RNA互补结台 收稿日期:2001—05一l】;修回日期:2001—07一O4 作者单位:210049南京军医学院生化教研室 时,中间保守序列即在该特定位点切断 。 2反义核酸技术在肿瘤治疗研究中的应用 2.1对肿宿细胞生长、增殖、分化的抑制及凋亡的诱导 在研究反义核酸技术在肿瘤抬疗中的作用时,多 运用肿瘤的体外传代细胞株实验,反义核酸技术可以 抑制肿瘤的生长、增殖、分化,还可以诱导其凋亡。 myc家族原癌基因表达产物是定位于桉内的 DNA结台蛋白,或转录调控中的反式调控因子,其激 活与人胃癌、食管癌、白血病、淋巴瘤等肿瘤的发生有 密切关系,其中 ̄-myc基因的表达产物,在白血病细胞 中浓度增加,将产生高水平c-myc反义RNA的载体转 染HL-60细胞后, ̄-myc蛋白的含量下降7O ,细胞增 殖变慢0]。陈洁平等用腺病毒介导的反义 ̄-myc,转导 胃癌细胞,能产生明显的体内及体外生长抑制效应并 诱导凋亡 -。 8 以上的肿瘤细胞和永生化细胞具有端粒酶 活性,它与维持端区的长度、细胞的永生化及癌变密 切相关。利用反义桉酸技术,抑制端粒酶以抑制肿瘤 细胞已数见报道,张晓伟等应用反义核酸技术,将端 粒酶RNA反向插入到整台型腺病毒载体中,转染 293细胞后获得反义重组病毒,将此反义重组病毒感 染乳腺癌细胞MCF一7后,使细胞端区长度由9.25kb 缩短至7.28kb,细胞的生长速度下降 。 最近几年里,PKC,cyclin及CDK基因在肿瘤细胞 中异常表达的研究受到广泛重视,这些基因的变异直 接影响到细胞的生长、增殖与分化。桑建利等利用反 义RNA技术抑制乳腺癌细胞PKCa基因的表达,结果 显示,细胞增殖速率明显减慢,cydinD1与CDK4的表 达水平下降 J。 人T细胞白血病病毒I型(HTLv_I)是逆转录病 毒,与成人T细胞白血病(ATL)有关。HTLV-I不带 典型的癌基因,它的基因组编码几个调节蛋白质,包括 分子量为40Ku的反式激活蛋白Tax,Tax可活化一些 细胞基因的启动子,它活化IL Z和IL_ZIh被认为与 ALT早期受HTLV-I感染的细胞的增殖有关。 外源基因表达不恰当造成转基因小鼠出现神经纤 维瘤、肾上腺髓质肿瘤等多种病理学变化。用tax反义 RNA专一的阻断或部分抑制tax基因在神经纤维瘤细
antivirals that inh ibit cytom egalovirus,antivirals that inh ibit herpesvirus and antivirals that inh ibit influenza virus.T h is review discusses their pharm aco logical p roperties,m ain adverse drug reac2 ti ons,therapeutic use and introduces som e advances in the research of antivirals.Key words A ntiviral agents Pharm aco logical p roperties T herapeutic use(收稿:1998207220,修回:1998211209)第二代反义寡核苷酸的研究Ξ朱冬晖 魏东芝(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 生物化学研究所 上海 200237)摘 要 第一代反义核酸寡核苷酸硫代磷酸酯,是目前研究最广泛、最成熟的反义核酸药物,已进入临床试验阶段,但其具有一定的毒副作用;第二代反义核酸,包括嵌合寡核苷酸、杂合寡核苷酸等,是在硫代寡核苷酸的基础上,再引入其它的修饰基团,从而提高其生物活性,减少毒副作用。
本文着重介绍了第二代反义核酸的生物物理学性质,药动学及其与第一代反义核酸毒性的比较。
关键词 反义寡核苷酸 化学修饰 生物物理学 药物动力学 副作用 反义寡核苷酸通过序列特异地与靶m RNA结合而抑制基因表达,从而可以成为一类理想的、在基因水平调控的治疗药[1,2]。
因具有较好的抗酶解活性,寡核苷酸硫代磷酸酯(p ho spho ro th i oate o ligonucleo tides, PS2ODN s),已成为目前最广泛研究的寡核苷酸类似物之一,并已应用于临床[3]。
反义RNA技术在基因沉默中的应用随着人类对基因的深入研究,我们在基因调控中发现了许多具有重要作用的分子。
反义RNA技术则是其中的一种,它通过干扰基因转录或翻译过程,使基因无法表达或表达受到限制。
在基因学和生物技术领域,反义RNA技术已成为一项重要的研究工具。
反义RNA技术的原理反义RNA技术是利用反义RNA分子对目标RNA分子进行结合和干扰,达到抑制基因表达或限制基因表达的目的。
在生物体内,RNA分子是纳米级别的分子,直接作用在RNA分子上的化合物自然界中非常少。
因此,人们使用合成小分子RNA,如siRNA和miRNA,作为靶向RNA分子的反义RNA分子。
siRNA分子是一种由21-25个核苷酸组成的RNA双链分子,可以在纳秒级别水平上将mRNA分子的特定区域“切断”,有效地抑制基因表达。
miRNA分子是一种由21-23个核苷酸组成的RNA单链分子,它们通过与mRNA分子RNA互补配对,阻止mRNA分子的翻译或影响其稳定性。
反义RNA技术的应用反义RNA技术除了用于研究基因功能外,还用于生物医学领域的基础研究。
通过反义RNA技术,可以研究特定基因的功能、筛选新药物、甚至开发基因治疗方法。
其中,基因治疗是应用反义RNA技术的一项前沿技术。
在生物研究中,反义RNA技术可用于沉默某些与重要疾病相关的基因,针对某些疾病的基因进行沉默,进而减轻或消除疾病的影响。
常用的沉默技术包括siRNA和shRNA(小干扰RNA和短发夹RNA),在这两种技术中,siRNA是使用最多的沉默技术。
siRNA导致的基因沉默是通过对靶向mRNA进行特异性水解的方式来实现的。
siRNA可以很好地沉默基因表达。
全新的RNA干扰技术是利用端粒酶伸展寡核苷酸开发的双链反式RNAs (D-RNAs) 来抵消基因抑制。
反式RNA是一种开启基因表达的新型技术,它在诱导沉默基因时能够有效地删除核酸序列,从而激活一些已被沉默的基因,达到治疗某些疾病的目的。
反义RNA技术与基因治疗:探究新型治疗手段基因治疗是指通过对患者的基因进行修复或替换来治疗疾病的一种方法。
在过去十年中,随着基因技术的不断发展和临床试验的不断深入,基因治疗已经成为了一种备受期待的治疗手段。
然而,这一方法所涉及的复杂性、成本和安全性等方面的挑战也让它备受争议。
近年来,反义RNA技术(antisense RNA)作为一种新型的治疗手段被人们重视。
它是一种通过在基因层面上进行调控从而治疗疾病的方法。
与基因治疗相比,反义RNA技术具有更低的风险和更高的可控性。
下面将从反义RNA技术的基本原理、研究进展以及优缺点等方面来探究一下这一新型治疗手段与基因治疗的联系。
一、反义RNA技术的基本原理反义RNA技术是从DNA翻译过程中产生灵感的。
在DNA的翻译过程中,通过基因转录,基因序列被转换为RNA序列,进而由RNA转录为蛋白质序列。
反义RNA技术则是引入一种与RNA 互补的反义RNA(antisense RNA)来抑制RNA的翻译,从而实现基因的靶向调控。
反义RNA本质上是一种短链的RNA,它是通过DNA作为模板来合成的。
与RNA具有互补配对的RNA序列将反义RNA与RNA永久绑定在一起,从而阻碍RNA的翻译。
基于这种原理,人们可以通过合成反义RNA来阻止异常基因的表达,达到治疗疾病的效果。
此外,反义RNA也可以被用来靶向细胞中正在进行的RNA剪切过程,从而切断或防止RNA序列的翻译。
二、反义RNA技术的研究进展目前,反义RNA技术已经被广泛应用于癌症、心脏病、糖尿病等各种疾病的治疗。
研究人员已经开发出了许多不同的反义RNA技术,包括小分子反义RNA、siRNA等。
其中,siRNA也是一种非常常见的抑制RNA翻译的手段。
siRNA是一种短链的RNA序列,通常由30个核苷酸组成,可以将RNA的翻译过程直接抑制,因此具有更快的反应速度和更高的有效性。
在癌症治疗方面,siRNA使用广泛。
研究人员可以通过siRNA 靶向肿瘤的关键基因来抑制癌症细胞的增殖,从而达到治疗癌症的效果。