计算机显微荧光光谱图象分析系统

光学显微成像技术原理分析光学显微成像技术是一种将物体的微小细节放大并显示到人类视野中的技术。

该技术的应用范围广泛，可以帮助科学家们研究微生物、细胞、组织等生物体系统。

在工业、医学和生物学研究领域，光学显微成像技术都扮演着重要的角色。

光学显微镜（OM）是一种使用可见光束的光谱成像技术。

它利用光学透镜系统将一个小样品放大，并显示在一个结果的图像上。

这个图像可以由人类视觉系统看到。

要理解OM的工作原理，首先我们需要了解光学成像原理。

成像原理可以用光的传播方式来解释。

当光经过一个介质（例如空气，玻璃或液体）时，它的速度会改变，这会影响光线的传播方式。

光进入透镜系统中时，透镜会将其聚焦并放大。

成像原理是基于光线的反向传播方式的。

当我们在看样品时，它的组成会影响样品在显微镜留下的光线。

例如，细胞的内部结构可以通过折射率差异和反射率来探测。

光学显微成像技术有许多种形式，包括亮场显微镜、荧光显微镜和偏光显微镜等等。

这些成像技术使用不同的技术来增强成像效果。

下面将对其中两种常见的成像技术进行简要介绍。

亮场显微镜是最常见的光学显微成像技术。

它使用亮光照射样品，并通过传输光使得样品成像。

它的原理是根据样品对光的吸收和散射效应来显示图像。

它适用于对内部结构不透明的样品进行观察。

例如，可以使用亮场显微镜观察昆虫的结构，该结构不透明且可以反射光线。

荧光显微镜则是专门用来观察荧光染料的成像技术。

在得到样品后，先使用荧光染料使特定的细胞或组织发出特定颜色的荧光。

这些荧光可以在黑暗的环境下被观察到，并通过摄像机记录下来。

荧光显微镜的优点是可以使各个标记成分之间更加清晰可见，扫描深度也比亮场显微镜更深。

总之，光学显微成像技术已经成为许多科学领域的重要工具。

我们继续不断提高技术的能力与灵敏性，使得它在医疗上，生命科学领域，以及研究各种工业领域均能发挥重要的作用。

激光显微共焦拉曼光谱系统附件一激光显微共焦拉曼光谱系统附件一一．货物需求：显微共焦拉曼光谱仪系统一套。

二．详细技术参数：系统的主要技术指标：1) 250mm焦长，系统总通光效率大于30%。

2）波长范围：200nm—1050nm。

3）光谱扫描范围：325nm 激发Raman(200-4000cm-1)，532nm 激发15–8000 cm-1，632.8nm 激发100-6000 cm-1，785nm 激发15-3200cm-1,1064nm激发100-3200 cm-1。

4）光谱分辨率：可见全谱段等于或小于1cm-1, 紫外(325nm)段<3cm-1，红外（1064nm）段<3cm-1。

5）光谱重复性（测量多少次50次）：≤±0.15cm-1。

6）空间分辨率：横向< 0.5微米，光轴方向< 2微米。

7）灵敏度：硅三阶峰信噪比好于 15: 1,并可见四阶峰；(指光谱仪无低波数附件时的灵敏度)。

8）低波数：小于或等于15cm-1(785nm激发)，15cm-1(532nm 激发)；9) CCD探测器：应使用紫外和近红外同时增强深耗散层型CCD探测器，优质芯片，半导体制冷到-70oC,为确保图像质量，避免边缘畸变，芯片尺寸应< 13×8.5mm，像元尺寸22 m。

10）第二探测器组件（InGaAs探测器）：0.9 um～1.65 um，包含软件包，液氮或半导体制冷。

11）光源及控制系统：632.8nm，≥17毫瓦；785nm, ≥275毫瓦；514.5nm，≥40毫瓦,325nm激光器30毫瓦。

12）可导入脉冲激光光源（405nm）进行瞬态测量，信号光可引入TCSPC，提供TCSPC探测器接口，（需考虑放滤光片位置）。

包含附件：1.直接二维拉曼成像功能（532/785 nm激发）。

2.大面积快速扫描拉曼成像功能。

3.三维拉曼成像功能。

3.冷热台及控制器（-195 o C to +600 o C）4.冷热台及控制器（室温 to +1500 o C）5.催化反应拉曼原位池（室温 to +1000 o C）6.TCSPC系统7.自动xyz三维平台。

光谱共焦成像原理光谱共焦成像（Spectral Confocal Imaging）是一种高分辨率的全息显微成像技术，可以通过获取目标材料的荧光光谱信息，实现样品的分子级别定位和化学组成分析。

下面将介绍光谱共焦成像的原理及其在科学研究和生物医学领域的应用。

光谱共焦成像的原理是基于光谱特性和共焦成像原理的结合。

在共焦显微镜中，通过光源的激发，显微镜可以将样品中激发的荧光信号集中到一个点上进行观察和记录。

而光谱共焦成像则在此基础上添加了光谱仪的功能，可以根据不同波长的荧光光谱信息对样品进行分析。

光谱共焦成像主要由以下几个组成部分构成：激光器、透镜系统、光谱仪和探测器。

首先，激光器产生经过准直、聚焦和偏转后的高亮度激光束。

然后，激光束通过透镜系统，将其聚焦到样品表面。

样品表面的荧光会被激发，并从样品表面向后散射。

聚焦的荧光信号被物镜再次聚焦到狭缝上，通过光谱仪进行光谱分离。

光谱仪是光谱共焦成像系统的关键组件，其作用是将荧光信号分解成不同波长的光谱。

光谱仪通常由光栅和光电探测器组成。

光栅通过光的衍射原理，将入射的光分解成不同波长的光谱，并通过光电探测器接收和记录。

光电探测器通常是一个高灵敏度的光电二极管，可以将光信号转换成电信号。

使用光谱共焦成像技术可以获得样品的荧光光谱信息，进而对样品进行分析。

常见的荧光分析包括：荧光发射光谱分析、荧光激发光谱分析和荧光时序扫描分析。

荧光发射光谱分析是通过激发样品产生的荧光，记录其发射的光谱分布。

不同分子或荧光染料在不同波长下的发射光谱特性不同，可以通过光谱仪测量记录发射光谱数据，从而获得样品的化学成分和结构信息。

荧光激发光谱分析是通过记录不同波长下样品的激发光谱分布。

不同波长的激发光可以激发样品中不同的分子或荧光染料，从而获得不同的激发光谱特性。

荧光时序扫描分析是通过记录样品在不同时间点上的荧光信号分布。

通过对样品的反应动力学过程进行时序扫描，可以研究样品的动态变化和反应速率等相关信息。

共聚焦显微镜激光共聚焦扫描显微镜在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非焦平面及焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清晰度。

在此基础上，由于计算机及相应的软件技术组合，可以对较厚样品进行连续光学切片及三维重建。

目前，激光共聚焦显微镜（LSCM）技术已广泛应用于生物医学领域。

本文对LSCM的应用原理、较普通光镜的优点及生物学应用做简单介绍。

激光共聚焦扫描显微镜是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。

其组成除光学显微镜部分之外主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集，处理，转换，应用软件）、图象输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。

在生物医学等研究领域中发挥重要作用，尤其在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维重建等方面，是传统的光学显微镜所望尘莫及的。

一: LSCM的主要组成部分及工作原理：illuminating pinhole:照明针孔功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。

且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。

beamsplitter:光束分离器功能：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。

Objective:物镜Focal plane:焦平面功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。

该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole 及detector pinhole两处聚焦。

共聚焦的含义由此而来。

detector pinhole:探测器针孔功能：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。

最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。

Vol. 41 ,No. 2,pp379-387February , 2021第41卷，第2期2021 年2 月光谱学与光谱分析SpectroscopyandSpectralAnalysis 基于光热效应的显微光谱技术在单粒子检测中应用和发展李少华x 赵洪霞x 温 晨x 丁志群x 王敬蕊x 程培红121.宁波工程学院电信学院，浙江宁波3152112.浙江大学硅材料国家重点实验室，浙江杭州310027摘 要 高灵敏度的单粒子检测技术是纳米粒子在生物医学、化学、光电子等领域应用的前提条件#常见的单粒子检测技术主要包括基于粒子的荧光、拉曼、散射和吸收等信号而发展起来的光学显微成像及光谱技 术#其中！拉曼光谱和荧光光谱技术主要适用于一些具有拉曼活性的分子/粒子或可发光的荧光分子或粒 子，然而即使对于荧光效率高的有机染料分子和半导体纳米粒子，固有的光漂白和blinking 现象也对单粒子探测形成了挑战#散射光谱测量是应用于单粒子检测的另外一种方法，从理论上讲，由于瑞利散射随着尺寸的减小而呈六次方减弱的趋势！在细胞或生物组织内！小尺寸粒子的散射信号很难从背景散射噪声中分离出来#众所周知！介质吸收激发光后会引起介质内的折射率变化！进而在光加热区附近出现折射率的梯度分布!称为光热效应(photothermal effect) #基于粒子光热效应的光学显微成像和光谱测量技术具有信号灵敏 度高、无背景散射、原位和免标记等优点，在单粒子检测领域展现了良好的应用潜力#综述了近年来基于光热效应的显微光谱技术在单粒子检测中应用和研究发展，首先介绍了光热效应的测量原理；接着分别讨论 了光热透镜测量技术、微分干涉相差测量技术和光热外差测量技术的实验装置，比较了各种测量技术的信噪比、灵敏度、分辨率等特点！并且介绍这些测量技术在单粒子检测中的应用研究进展；接着！论述了近年 来研究人员在提高光热显微测量的信噪比、改善动态测量性能以及在红外波段拓展等方面的最新研究成果'最后！简单总结了光热测量技术在单粒子检测领域所面临的挑战#关键词 单粒子检测；光热显微镜；光热效应中图分类号：0657.3 文献标识码：RDOI ： 10. 3964/j. issn. 1000-0593(2021)02-0379-09引言由于具有小尺寸效应、表面效应以及量子效应，纳米粒子在光、电、热等方面均表现出优异的特性！被广泛应用于 生物、电子、光学、医学等领域)14*#受其尺寸限制！单粒子 的简单灵敏的检测方法对其应用来讲是至关重要的#目前！单粒子的光学检测方法普遍采用SERS 和激光诱导荧光信号等测量方法)59*#但是!这类检测主要局限在具有SERS 活性的粒子或可发光的荧光分子或粒子#并且，即使对于发光性 能较好的有机染料分子和半导体纳米粒子！固有的光漂白和blinking 现象也对单粒子探测形成了挑战#光散射测量是应用于超细粒子的显微成像和检测的另外一种方法，但从理论 上讲，受液体背景下瑞利散射截面所限，最小的探测尺寸大约为80 nm #文献已有报道!在表面等离子共振频率的暗场收稿日期：2019-12-26,修订日期：2020-03-17基金项目：国家自然科学基金项目(1605097)浙江省公益技术研究计划项目(LGC20F050001)资助作者简介：李少华，1998年生，宁波工程学院电信学院硕士研究生e-mail : 3067528894@* 通讯作者e-mail ： ********************照明下结合微分干涉对比技术和视频增强技术可探测到直径小于40 nm 金属粒子)10*#然而!由于瑞利散射随着尺寸的减小而呈六次方减弱的趋势，在细胞或散射组织内，小尺寸粒子的散射信号很难从背景散射噪声中分离出来#众所周知，介质吸收电磁波后！部分或者全部激发能会转化为热能#20世纪70-80年代!研究人员基于这种能量 的弛豫机制发展了基于光热效应的光谱技术)1116*。

显微共焦角分辨光谱仪微纳光子结构研究领域的重大突破用于显微角分辨光谱测量全球第一套成熟商业化设备Eric Zhang[2012-10-10]2012a产品介绍微区角分辨光谱测量系统是复享的专利产品，它能够针对微小样品进行角度分辨光谱测量，是研究微纳光学结构、光子晶体纳米纤维的利器。

复享为您提供两种规格的配置，一种介于商用显微镜，另一种基于定制显微镜。

使用定制显微镜，可以达到更加宽泛的光谱范围该设备是目前在显微角分辨光谱测量领域唯一的成熟商业化设备。

显微共焦角分辨光谱仪（Microscope-based confocal angular-resolute spectrometer, MCAS）是一种先进的微纳光子学研究仪器。

它在荧光显微镜成像的基础上加装傅立叶变换角分辨扫描装置，结合成像光谱技术，采集微纳光子材料的角度分辨反射光谱、辐射光谱，获取光与材料的复杂相互作用信息。

复享显微共焦角分辨光谱仪基于显微平台，采用一体化紧凑设计，融入共焦模块，能够获得清晰的显微角分辨图谱，已经应用于多个国内一流科研院所，正逐步成为先进光子材料领域的重要测试手段。

图1.显微共焦角分辨光谱仪适用领域同时解决显微和角分辨的光谱测量需求，所有需要对微尺寸样品光谱角度特性经行研究的领域例如：●光子晶体（Photonic Crystals）、●光子特异材料（Meta-materials）、●表面等离子体激元（SPPs）●纳米纺丝材料●光栅开发设计和研究原理及构造图2，显微共焦角分辨光谱仪内部结构示意图显微共焦角分辨光谱仪（MCAS）的主要原理是利用傅立叶变换器件，将样品不同角度的发射光分解到不同空间位置，再通过空间扫描部件（SCAN），将样品各角度发射光采集至光谱分析仪，经过信号处理，在计算机上形成角度-光谱图像。

共焦是指在样品的角度辐射光谱经过傅立叶变换装置变换为空间分布光谱后，再经过针孔共焦器件，以滤除样品非焦平面上的杂散光和衍射光，增强采集图像的信噪比和角度分辨率。

第五篇 光谱分析第四章 拉曼光谱分析——激光显微共焦拉曼光谱仪拉曼散射是印度科学家Raman 在1928年发现的，拉曼光谱因之得名。

光和媒质分子相互作用时引起每个分子作受迫振动从而产生散射光，散射光的频率一般和入射光的频率相同，这种散射称为瑞利散射，由英国物理学家瑞利于1899年进行了研究。

但当拉曼在他的实验室里用一个大透镜将太阳光聚焦到一瓶苯的溶液中，经色散分光过滤后的太阳光呈蓝色，但是当光束进入溶液之后，除了入射的蓝光之外，拉曼还观察到了很微弱的绿光。

拉曼认为这是光与分子相互作用而产生的一种新频率的光谱带。

因为这一重大发现，拉曼于1930年获诺贝尔物理学奖。

拉曼光谱得到的是物质分子的振动光谱，是物质的指纹性信息，即每一种物都有自己特征拉曼谱图，因此拉曼光谱是认证物质和分析成分的有力工具。

而且拉曼峰的频率（或波数）对物质结构的微小变化非常敏感，所以也常通过对拉曼峰的微小变化的观察，来研究在一些条件下，比如温度、压力、掺杂等，所引起的物质结构变化，以及间接推出材料不同部分微观上的环境因素的信息，如应力分布等。

拉曼光谱技术的优点：光谱的信息量大，谱图易辨认，特征峰明显；对样品无接触，无损伤；样品无需进一步处理；快速分析，鉴别各种材料的特性与结构；由于激光拉曼光谱仪还带有显微共焦功能，故又称激光显微共焦拉曼光谱仪，可做微区微量以及分层材料的分析（1微米左右光斑）；高空间分辨率对地质的包裹体尤其有用；能适合黑色和含水样品；高、低温及高压条件下测量；光谱成像快速、简便，分辨率高；仪器稳固，体积适中，维护成本低，使用简单。

激光拉曼光谱是激光光谱学中的一个重要分支，应用十分广泛。

如在化学方面应用于有机和无机分析化学、生物化学、石油化工、高分子化学、催化和环境科学、分子鉴定、分子结构等研究；在物理学方面应用于发展新型激光器、产生超短脉冲、分子瞬态寿命研究等，此外在相干时间、固体能谱方面也有广泛的应用。

一、基本原理当波数为 （频率为 ）的单色光入射到介质上时，除了被介质吸收、反射和透射外，总会有一部分被散射。

珠宝鉴定大型仪器在宝石鉴定时，常规鉴定仪器有时不能满足要求，这时采用大型仪器常可解决问题。

因此，国、内外大的宝石鉴定机构、实验室、研究所均备有各类大型仪器以做鉴定、研究之用。

一、红外光谱仪1、方法原理：物质的分子在红外线的照射下，吸收与其分子振动、转动频率一致的红外光。

利用物质对红外光区电磁辐射的选择性吸收，对珠宝玉石的组成或结构进行定性或定量分析。

红外光波长0.75-1000μm(0.78-1000μm)能量均小于1ev波长μm波数cm-1近红外区（泛频区） 0.75-2.5μm13334-4000中红外区（基本振, 动区） 2.5-25 &, amp;, nbsp; 4000-400远红外区（转动区）25-1000 400-10红外光谱分析结构常以波数作横坐标，以透射百分率或吸收百分率作纵坐标作图。

波数：波数是每厘米中波的数目，用cm-1表示，其数值等于波长（波长以厘米为单位）的倒数。

红外区划分为三个区为近红外区、中红外区、远红外区，但只有中红外区的1250-400cm-1频区是宝石矿物鉴定的指纹区，而4000-1250cm-1特征频率区主要用于宝石中可能存在的官能团。

2、仪器红外光谱仪：傅立叶变换红外光谱仪、光栅式红外光谱分析仪3、测量方法(1)无损鉴定：透射、反射、显微红外光谱。

(2)有损鉴定：1μm样品，研磨成粉末，掺溴化钾，压成簿片，有效性可提高8倍。

4、应用(1)宝玉石品种（物相）的鉴别如钻石与CZ、YAG等红外光谱图有明显区别。

矽线石、柱晶石、透辉石、S·G、R·I相近，不易区别，可采用红外显微镜反射法测定矿物的频振动鉴别。

(2)钻石中杂质原子的存在形式及类型划分钻石主要由碳原子组成，当其晶格中存在少量的N、B、H等杂质原子时，可使钻石的物理性质如颜色、导热性、导电性等发生明显的变化。

基于红外吸收光谱特征，有助于确定杂质原子的成分及存在形式，并作为钻石分类的主要依据之一。

各种超分辨显微技术的比较分析超分辨显微技术已经成为了现代生命科学和物理学中不可或缺的一部分。

解析细胞和物质的微观结构、研究分子间作用及其生命过程都需要高分辨显微技术，迅速发展的这个领域已经引起了业内人士的广泛关注。

超分辨显微技术通过不同的物理方法（如近场光学、单分子成像、激发共振拉曼光谱等）或者计算解决方案（如图像重构算法），实现了极高的分辨率，超出了传统光学显微镜的限制。

本文将对几种超分辨显微技术进行比较分析，包括STED显微镜、PALM/STORM显微镜、SIM显微镜、以及一些其他基于计算机学习的超分辨率图像重建算法。

1. STED显微镜STED显微镜是基于烟花草的奖赏获得者斯特凡·杜鲁普的成果开发出的高分辨显微技术，利用荧光产生器激光束来激发样本，并通过STED激光束在一个小的区域内去除荧光产生器的光，使其只在一个小的、观察对象的核心区域内荧光，从而达到提高垂直和水平分辨率的目的。

该技术具有极快的成像速度和较大的观察面积，同时也具有较高的空间分辨率。

然而，在操作上需要高度的技术水平和较昂贵的设备成本。

2. PALM/STORM显微镜PALM/STORM显微镜是一种基于单分子荧光技术的超分辨显微技术。

它利用荧光微球群或荧光酶对标记的蛋白和其他分子标记，通过激光单步激发一个荧光微球群(坐标)或是荧光分子(中心)，并记录下其位置、亮度和时间的方式来重建目标分子的空间位置。

PALM/STORM技术可以在不同空间和时间尺度下探索细胞结构和功能，具有高强度的表征能力和超高的空间分辨率，但也存在成像速度和操作技术的要求较高问题。

3. SIM显微镜SIM显微镜利用束缚激发荧光技术来达到超分辨率的目的。

SIM显微镜与STED显微镜的不同之处在于：STED显微镜只针对样本的核心区域，而SIM显微镜则针对整个样本特定区域的荧光造成的荧光光点进行图像的旋转扫描；这种模式下，确保了样品在不同方向下的荧光产生器，使得其可以确保更高的空间分辨率。

探讨用sem_eds分析材料的碳含量篇一：SEmEdSSEm、EdS一、实验目的1、了解扫描电镜和能谱仪的基本结构与原理2、掌握扫描电镜和能谱仪样品的准备与制备方法3、掌握扫描电镜和能谱仪的基本操作步骤4、了解实验结果的分析与讨论二、实验原理1、扫描电镜的工作原理扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体的外观形貌。

图1扫描电镜示意图从电子枪阴极发出的直径几个纳米的电子束，受到阴阳极之间加速电压的作用，射向镜筒，经过聚光镜及物镜的会聚作用，缩小成直径约几毫微米的电子探针。

在物镜上部的扫描线圈的作用下，电子探针在样品表面作光栅状扫描并且激发出多种电子信号。

这些电子信号被相应的检测器检测，经过放大、转换，变成电压信号，最后被送到显像管的栅极上并且调制显像管的亮度。

显像管中的电子束在荧光屏上也作光栅状扫描，并且这种扫描运动与样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样即获得衬度与所接收信号强度相对应的扫描电子像，这种图象反映了样品表面的形貌特征。

2、X射线能谱分析原理X射线能量色散谱分析方法是电子显微技术最基本和一直使用的，具有成分分析功能的方法，通常称为X射线能谱分析法，简称EdS或EdX方法。

利用EdS可以在10s以内把试样里所含的浓度在10%（重量百分比）以上所有能量高于1Kev的元素分析出来，并可以在100s 之内把微量到0.5%的元素分析出来。

图2EdS系统框图a、X射线经过薄铍窗进入一个反向偏压的被浸在液氮里冷却的锂漂移硅晶体，这个晶体把X射线能量转换成电荷脉冲；b、电荷脉冲由前置放大器转换成电压脉冲，放大后通过电缆把脉冲信号送到脉冲处理器中去，在处理器中进一步放大；c、放大后的信号由模/数转换器转换成数字信号，并被送入多道分析器，由荧光屏显示出来；d、经多道分析器的信号同时经电脑处理，成为我们需要的数据。

三、主要仪器设备及耗材1、KYKY1000B扫描电镜2、JdS2300X射线色散能谱分析仪3、SBc—12离子溅射仪（样品喷涂导电层用）4、银导电胶、双面胶（制样用）四、实验步骤1、SEm的操作步骤：（一）制样对所测的样品进行简单的清洗干燥，对表面不带电、导电性能差的样品在用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。