显微镜成像方法与技术-3

实验三电子显微镜技术的演示背景知识：普通光学显微镜通过提高和改善透镜的性能，使放大率达到1000~1500倍左右，但一直未超过2000倍。

这是由于普通光学显微镜的放大能力受光的波长的限制。

为了从更高的层次上研究物质的结构，必须另辟蹊径，创造出功能更强的显微镜。

20世纪20年代法国科学家德布罗意发现电子流也具有波动性，其波长与能量有确定关系，能量越大波长越短，比如电子学1000伏特的电场加速后其波长是0.388埃，用10万伏电场加速后波长只有0.0387埃，于是科学家们就想到是否可以用电子束来代替光波，这是电子显微镜即将诞生的一个先兆。

用电子束来制造显微镜，关键是找到能使电子束聚焦的透镜，光学透镜是无法会聚电子束的。

1926年，德国科学家蒲许提出了关于电子在磁场中运动的理论。

他指出：“具有轴对称性的磁场对电子束来说起着透镜的作用。

”这样，蒲许就从理论上解决了电子显微镜的透镜问题，因为电子束来说，磁场显示出透镜的作用，所以称为“磁透镜”。

1931年，德国柏林工科大学的Knoll和Ruska制作成功第一台电子显微镜──它是一台经过改进的阴极射线示波器，成功地得到了铜网的放大像──第一次由电子束形成的图像，加速电压为7万，最初放大率仅为17倍。

尽管分辨率还不如光学显微镜高，但它却证实了使用电子束和电子透镜可形成与光学像相同的电子像。

经过不断地改进，1933年Ruska和Bodo Von Borries又制成了第二台两级短焦距的电子显微镜，获得了金属箔和纤维的放大1万倍的电子图像。

虽然放大率得到提高，但分辨率当时还刚刚达到光学显微镜的水平。

1937年应西门子公司的邀请，Ruska建立了超显微镜学实验室。

1939年西门子公司制造出分辨本领达到30埃的世界上最早的实用电子显微镜，并投入批量生产。

随后，透射电镜的商业产品由美国无线电公司于1941年开始制作生产。

电子显微镜的出现使人类的洞察能力提高了好几百倍，不仅看到了病毒，而且看见了一些大分子，即使经过特殊制备的某些类型材料样品里的原子，也能够被看到。

超分辨显微镜的工作原理与成像技术超分辨显微镜是一种先进的光学显微镜，具有很高的分辨率和成像能力，可以观察到微观领域中细小的结构和现象。

本文将介绍超分辨显微镜的工作原理和成像技术，以及其在生物医学、材料科学和纳米技术等领域的应用。

一、工作原理超分辨显微镜的工作原理基于曲折规律和波的衍射。

传统光学显微镜由于照明光束的衍射限制，无法分辨出比光的波长还要小的物体细节。

而超分辨显微镜通过使用特殊的技术，克服了这一限制。

1.1 衍射极限传统光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制。

衍射极限（称为耐克斯特准则）是由德国物理学家安德烈亚斯·耐克斯特提出的，规定了光学系统能够分辨物体的最小尺寸，即0.61倍的照明光波长。

超过这个极限，显微镜就无法分辨出物体的细节。

1.2 超分辨技术超分辨显微镜采用了多种技术来突破衍射极限，实现更高的分辨率。

其中最常见的技术包括：1.2.1 利用荧光标记超分辨显微镜可以通过利用荧光标记结合合适的成像技术，将被观察物体的特定部分标记出来，并对其进行成像。

这些标记物在光的刺激下会发出荧光信号，通过检测和分析这种信号，可以实现纳米级的分辨率。

1.2.2 利用近场效应近场光学显微镜利用装载在探针尖端的金属纳米结构，利用探针与样品之间的极短距离来增强照明光的局部电场，从而实现超分辨成像。

这种技术在表面等离子激元共振和原子力显微镜中得到广泛应用。

1.2.3 利用建构性干涉通过将两束光进行干涉，可以在显微镜中形成特定的干涉模式。

这种模式包含了被观察物体的高频细节信息。

运用适当的算法和数学处理，可以从干涉模式中提取出高分辨率的图像。

二、成像技术超分辨显微镜采用多种成像技术来获取高分辨率图像。

以下是几种常用的成像技术：2.1 结构光成像结构光成像利用相干光束通过物体表面，通过记录物体与光束的相互作用，实现高分辨率的三维成像。

利用这种技术，可以获得具有亚微米分辨率的物体表面拓扑图像。

2.2 荧光成像荧光成像是利用带有荧光标记的样品在激发光线照射下发出的荧光信号进行成像。

光学显微成像技术原理分析光学显微成像技术是一种将物体的微小细节放大并显示到人类视野中的技术。

该技术的应用范围广泛，可以帮助科学家们研究微生物、细胞、组织等生物体系统。

在工业、医学和生物学研究领域，光学显微成像技术都扮演着重要的角色。

光学显微镜（OM）是一种使用可见光束的光谱成像技术。

它利用光学透镜系统将一个小样品放大，并显示在一个结果的图像上。

这个图像可以由人类视觉系统看到。

要理解OM的工作原理，首先我们需要了解光学成像原理。

成像原理可以用光的传播方式来解释。

当光经过一个介质（例如空气，玻璃或液体）时，它的速度会改变，这会影响光线的传播方式。

光进入透镜系统中时，透镜会将其聚焦并放大。

成像原理是基于光线的反向传播方式的。

当我们在看样品时，它的组成会影响样品在显微镜留下的光线。

例如，细胞的内部结构可以通过折射率差异和反射率来探测。

光学显微成像技术有许多种形式，包括亮场显微镜、荧光显微镜和偏光显微镜等等。

这些成像技术使用不同的技术来增强成像效果。

下面将对其中两种常见的成像技术进行简要介绍。

亮场显微镜是最常见的光学显微成像技术。

它使用亮光照射样品，并通过传输光使得样品成像。

它的原理是根据样品对光的吸收和散射效应来显示图像。

它适用于对内部结构不透明的样品进行观察。

例如，可以使用亮场显微镜观察昆虫的结构，该结构不透明且可以反射光线。

荧光显微镜则是专门用来观察荧光染料的成像技术。

在得到样品后，先使用荧光染料使特定的细胞或组织发出特定颜色的荧光。

这些荧光可以在黑暗的环境下被观察到，并通过摄像机记录下来。

荧光显微镜的优点是可以使各个标记成分之间更加清晰可见，扫描深度也比亮场显微镜更深。

总之，光学显微成像技术已经成为许多科学领域的重要工具。

我们继续不断提高技术的能力与灵敏性，使得它在医疗上，生命科学领域，以及研究各种工业领域均能发挥重要的作用。

3d显微镜技术原理3D显微镜技术原理引言：3D显微镜技术是一种先进的显微镜技术，它可以提供具有深度感的三维显微图像。

这种技术在许多领域有着广泛的应用，如生物医学研究、材料科学和纳米技术等。

本文将介绍3D显微镜技术的原理及其应用。

一、3D显微镜技术的基本原理1. 光学原理：3D显微镜技术是基于光学原理实现的。

当光线通过样品时，会发生散射和折射现象。

通过对光线的散射和折射进行测量和分析，可以获得样品的三维形貌信息。

2. 双目视差原理：3D显微镜技术利用双目视差原理来实现对样品的三维成像。

通过在显微镜中加入两个成像系统，分别对样品进行观察，然后通过计算两个成像系统之间的视差，可以获得样品的三维信息。

3. 图像处理算法：为了获得更准确的三维图像，3D显微镜技术还需要进行图像处理。

常用的图像处理算法包括双目视差算法、结构光投影算法和相位测量算法等。

这些算法可以提取图像中的深度信息，并生成真实的三维图像。

二、3D显微镜技术的应用1. 生物医学研究：3D显微镜技术在生物医学研究中有着广泛的应用。

通过观察和分析生物样品的三维结构，可以揭示生物体内部的微观结构和功能。

例如，在细胞研究中，可以利用3D显微镜技术观察细胞的形态和内部结构，进而研究细胞的功能和疾病发生机制。

2. 材料科学：3D显微镜技术在材料科学领域也有着重要的应用。

通过观察和分析材料的三维形貌和微观结构，可以研究材料的性能和功能。

例如，在金属材料研究中，可以利用3D显微镜技术观察金属晶粒的形态和分布，进而研究金属材料的力学性能和耐腐蚀性能。

3. 纳米技术：3D显微镜技术在纳米技术领域有着重要的应用。

由于纳米材料具有特殊的物理和化学性质，利用传统的显微镜技术往往无法观察到纳米结构的细节。

而3D显微镜技术可以提供高分辨率的三维图像，能够观察到纳米材料的形貌和结构。

三、3D显微镜技术的发展趋势1. 高分辨率：随着器件制造技术的不断进步，3D显微镜技术的分辨率也在不断提高。

光学显微镜技术第一章概述第一节显微镜的作用人眼对微观世界观察的局限性光学显微镜是人类探索微观世界的光学精密仪器光学显微镜的发展在很大程度上决定了人们对生命现象的认识第二节显微镜的类型根据照明源的性质一、光学显微镜：利用可见光（或紫外光）为照明源，一般有单式及复式显微镜两类。

复式显微镜可分为：1.普通型：常规使用。

2.特种型：如荧光、相衬显微镜等；供专门观察和研究。

3.高级型：万能显微镜。

4.共焦激光扫描显微镜（Confocal）。

第三节光学显微镜的发展简史1625年法布尔提出显微镜的概念1610年伽利略制造出具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜1611年开普勒说明了显微镜的原理1665年虎克制造出放大140倍的显微镜，提出“Cell”的概念1684年惠更斯制造出双透镜目镜：惠更斯目镜19世纪阿贝提出显微镜的完整理论1902年艾夫斯建立了双目镜系统1935年泽尼克发现了相衬原理，并因此获得诺贝尔奖20世纪60年代微分干涉衬显微镜问世20世纪80年代共焦激光扫描显微镜开始应用第四节显微镜的基本光学原理一、折射与折射率光线的折射现象物质的折射率二、透镜的性能凸透镜可以会聚光线凹透镜可以发散光线三、透镜的成像质量象差：是指透镜所形成的象与理想象在形状、颜色等方面存在差异。

色差：由于不同的颜色光线折射率差异而形成的象差。

色差的校正（1）采用单色光为光源。

（2）利用透镜的性质。

四、显微镜的成象（几何成象）原理利用凸透镜成象原理物镜成象：利用物体在凸透镜一倍焦距以外二倍焦距以内，成倒立的放大的实象。

目镜成象：是利用物体在凸透镜一倍焦距以内，成正立的放大的虚象。

显微镜成象原理：第二章、显微镜的主要光学技术参数第一节数值孔径（Numerical Aperture，NA）数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体间介质的折射率（η）和孔径角（u）半数正弦的乘积。

用公式表示：NA= ηsin u/2数值孔径代表了物镜或聚光镜光通量的大小，是衡量物镜或聚光镜性能高低的重要指标。

显微镜光学原理及技术参数详解目录1 第一章：显微镜简史 (2)2 第二章显微镜的基本光学原理 (2)2.1 折射和折射率 (2)2.2 透镜的性能 (2)2.3 影响成像的关键因素—像差 (2)2.3.1 色差（Chromatic aberration） (3)2.3.2 球差(Spherical aberration) (3)2.3.3 慧差(Coma) (3)2.3.4 像散（Astigmatism） (3)2.3.5 场曲（Curvature of field） (4)2.3.6 畸变（Distortion） (4)2.4 显微镜的成像（几何成像）原理 (4)2.5 显微镜光学系统简介 (5)3 第三章显微镜的重要光学技术参数 (5)3.1 数值孔径 (6)3.2 分辨率 (6)3.3 放大率 (7)3.4 焦深 (7)3.5 视场直径（Field of view） (7)3.6 覆盖差 (8)3.7 工作距离 (8)4 第四章显微镜的光学附件 (8)4.1 物镜 (9)4.2 目镜 (11)4.3 聚光镜 (11)4.4 显微镜的照明装置 (12)4.5 显微镜的光轴调节 (13)5 第五章各种显微镜检术介绍 (14)5.1 金相显微镜 (14)5.2 偏光显微镜（Polarizing microscope ） (17)5.3 体视显微镜（Stereo microscope） (19)1第一章：显微镜简史随着科学技术的进步，人们越来越需要观察微观世界，显微镜正是这样的设备，它突破了人类的视觉极限，使之延伸到肉眼无法看清的细微结构。

显微镜是从十五世纪开始发展起来。

从简单的放大镜的基础上设计出来的单透镜显微镜，到1847年德国蔡司研制的结构复杂的复式显微镜，以及相差，荧光，偏光，显微观察方式的出现，使之更广范地应用于金属材料，生物学，化工等领域。

2第二章显微镜的基本光学原理2.1折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现像，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。

生物细胞的三维显微成像和分析方法随着科技的不断发展，生物学领域的研究也得到了前所未有的发展。

其中，生物细胞的研究成为热门话题之一。

生物细胞是指生命体中最基本的结构单位。

它具有很强的复杂性和多样性，研究其结构和功能十分重要。

生物细胞的研究成果对于医学、环保、食品和工业等领域具有广泛的应用价值。

而现代生物学中，生物细胞的三维显微成像和分析方法是不可或缺的。

本文将从显微镜技术和成像方法两个方面探讨生物细胞的三维显微成像和分析方法。

显微镜技术当前常用的生物细胞三维成像和分析方法主要依赖于某些显微镜技术，包括光学显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、三维结构光显微镜、电子显微镜、原子力显微镜、多光子显微镜等技术。

光学显微镜是一种使用可见光成像技术的显微镜，是生物学研究中最常用的显微镜。

它可以通过透射光成像或者反射光成像来观察细胞组织的结构和分布。

这种显微镜的成像分辨率不高，但是便于操作，因此广泛应用于生物学研究。

与光学显微镜不同，共聚焦激光扫描显微镜（confocal microscopy）利用数码成像和激光共聚焦技术来观察生物细胞。

它激光扫描的同时，通过逐渐减小探底孔径、选择光的反射或荧光来收集图像数据，进而还原出三维图像。

共聚焦激光扫描显微镜具有高侦测灵敏度、高分辨率和成像精度高等特点，成为研究细胞形态和三维结构的主要工具之一。

另外，三维结构光显微镜（structured illumination microscopy）是一种新型的三维成像技术。

它通过腔调控光场的特殊模式，针对样品器表面对光场传播过程中产生的像差进行校正和补偿，关键近场成像技术将器表特征量化并可视化成立体图像。

这种三维成像技术具有成像效率高、成像分辨率高等优势。

成像方法高分辨率的成像方法是三维显微成像的重要支撑技术，其中景深成像技术和荧光成像技术具有广泛的应用价值。

景深成像技术是一种普遍存在于光学成像系统中的技术。

它采用调节各点焦距/光程的方法来为图像增加景深，能够有效解决高倍率下聚焦范围狭窄的问题。

光学显微镜的超长工作距离与深部组织成像光学显微镜是生物学、医学和材料科学等领域的重要工具。

然而，传统的光学显微镜在观察深部组织时存在一定的局限性。

本文将探讨光学显微镜的超长工作距离与深部组织成像的原理和方法。

1. 超长工作距离显微镜的原理超长工作距离显微镜是一种特殊的显微镜设计，其主要特点是具有超长的工作距离。

传统显微镜的工作距离较短，当观察深部组织时，显微镜的物镜容易接触到样品，导致观察不清晰。

而超长工作距离显微镜可以保持物镜与样品之间的距离，从而获得更清晰的深部组织成像。

超长工作距离显微镜的实现主要依赖于两个方面：一是采用超长工作距离物镜，其具有较大的焦距和较小的数值孔径；二是采用超长工作距离载物台，其可以容纳较大的样品厚度。

2. 超长工作距离显微镜的优点超长工作距离显微镜在深部组织成像方面具有以下优点：1.避免物镜与样品的接触：传统显微镜在观察深部组织时，物镜容易接触到样品，导致成像不清晰。

超长工作距离显微镜可以保持物镜与样品之间的距离，避免接触，获得更清晰的成像。

2.适用于较大样品：超长工作距离显微镜的载物台可以容纳较大的样品厚度，适用于观察较大的样品，如切片、组织块等。

3.减少光学干扰：传统显微镜在观察深部组织时，容易受到光学干扰，如反射、散射等。

超长工作距离显微镜可以减少这些干扰，获得更真实的深部组织成像。

3. 深部组织成像的方法为了获得更清晰的深部组织成像，可以采用以下方法：1.光学切片技术：通过调整物镜与样品之间的距离，获得不同深度的光学切片。

然后将这些切片进行合成，形成一个三维图像。

这种方法可以获得较清晰的深部组织成像，但需要较长的处理时间。

2.波段滤光片技术：通过改变波段滤光片的波长，可以选择性地观察不同类型的组织成分。

例如，使用绿色滤光片可以观察到细胞核，而红色滤光片可以观察到血管等。

这种方法可以提高观察的准确性，但需要对样品进行染色处理。

3.激光扫描显微镜：利用激光扫描技术，可以在样品上扫描激光束。

激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。

它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。

本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。

一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。

在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。

与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。

换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。

对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。

二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。

1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。

在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。

荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。

2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。

双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。

在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。