植物愈伤组织诱导与植株再生培养体系建立

多年生黑麦草品种夜影再生体系的建立黄锐【摘要】分别以多年生黑麦草品种夜影的成熟胚和生长点为外植体，在6种培养基上进行愈伤组织诱导，比较接种60 d时的诱导率及愈伤组织形态，并将继代培养后的胚性愈伤组织转接到4种不同的分化培养基上进行再生苗分化。

结果表明，生长点愈伤组织诱导率和分化率明显高于成熟胚，5.0 mg/L的2，4-D是诱导黑麦草品种夜影愈伤组织的最佳浓度，胚性愈伤组织在添加1.0 mg/L 6-BA的培养基上分化率最高。

【期刊名称】《甘肃农业科技》【年(卷),期】2016(000)006【总页数】4页(P28-30,31)【关键词】黑麦草;品种;夜影;愈伤组织;再生体系【作者】黄锐【作者单位】甘肃省农业科学院产业开发管理处，甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】S543;Q813.1黑麦草是具有世界栽培意义的牧草和草坪草［1-2］。

在草坪产业中，品种的改良一直是一个重要的问题。

传统的草坪草品种改良一直依靠常规育种方法，由于草坪草种类繁多，多为多倍体、多年生以及异交等原因，传统育种方法受到一定的限制。

近年来随着植物基因工程技术的迅速发展，转基因技术在草坪草的品种改良中受到越来越广泛的重视，而植物组织培养是进行遗传转化的基础，黑麦草组织培养体系的建立对草坪业的发展有重要意义。

笔者以常用多年生黑麦草品种夜影为供试材料，用不同外植体在含不同浓度植物激素的培养基上进行培养，旨在筛选出培养多年生黑麦草品种夜影的最佳培养基，并建立其高效再生体系。

1.1 供试材料供试材料为多年生黑麦草品种夜影，购于兰州种子供销公司。

1.2 方法1.2.1 愈伤组织的诱导采用2种不同外植体进行愈伤组织诱导。

①用解剖刀将黑麦草成熟种子消毒后沿延长轴线一分为二切开，接种于添加不同浓度外源激素的愈伤组织诱导培养基（表1）上，25 ℃暗培养。

②将黑麦草成熟种子消毒后种于MS培养基上，待发芽7 d后剪下幼苗，于解剖镜下取生长点位置上下约0.5 cm的小段，用解剖刀纵切生长点后接于不同外源激素浓度的愈伤组织诱导培养基（表1）上，25 ℃暗培养。

拟南芥植物组织培养 WTD standardization office【WTD 5AB- WTDK 08- WTD 2C】拟南芥组织培养一、种子消毒：方法一：将拟南芥种子置于1 .5 ml eppendorf 管(微量离心管)中，加入1 ml 蒸馏水，4C春化3 d，70 %（v／v ）乙醇1mi n、7 %（v／v ）次氯酸钠10 mi n 浸泡消毒，并用无菌水冲洗5 次。

方法二：在超净工作台内，用无菌蒸馏水浸泡1 min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次备用。

消毒完毕的种子可以用200ul的tips吸去洗涤液，然后在超净工作台上挥发掉残余水分、洗涤液。

方法三、取野生型拟南芥种子放人离心管内，75％乙醇清洗后，无菌蒸馏水清洗1—2次，转入无菌离心管；5％次氯酸钠溶液浸泡5—6 min，用无菌蒸馏水清洗3～4次，加入1 ml无菌水，用移液枪接种。

二、选用的培养基选用1/2MS培养基对种子进行培养。

（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减半，其他东西和ms培养基是一样的量。

糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染。

如果在平板上要生长时间比较长，需要做一些实验的，比如根的发育，最好不要加。

）也可以用MS+30 g／L蔗糖的固体培养基。

（我想两种培养基都接种上，比作对比确定好坏）。

MS培养基配料表：三：接种方法拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS 生长培养基的培养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。

（如不行，可适当添加琼脂）。

四、培养得无菌苗接种后置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。

3天后即可取材用于器官离体再生实验。

萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2 MS培养基的50ml三角瓶中（每瓶4--6棵，视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。

一、实验目的1. 掌握无菌操作的植物组织培养方法；2. 通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法；3. 通过诱导植物叶片形成愈伤组织，学习愈伤组织的建立方法；4. 了解植物细胞通过分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的过程，加深对植物细胞全能性的理解；5. 探讨不同激素配比对植物愈伤组织形成的影响。

二、实验原理植物组织培养是利用植物细胞的全能性，通过特定的培养基和条件，使植物细胞或组织在体外条件下生长发育成完整植株的技术。

植物组织培养主要包括脱分化、再分化两个过程。

脱分化是指植物组织在培养条件下，由已分化的细胞重新获得分裂和分化的能力，形成愈伤组织；再分化是指愈伤组织在特定条件下，通过细胞分裂、增殖、分化等过程，形成具有特定形态和功能的器官。

三、实验材料与仪器实验材料：- 植物叶片（如小麦、水稻、玉米等）- MS培养基母液- 乙醇、氯化汞（HgCl2）、次氯酸钠等消毒剂- 琼脂- 烧杯、量筒、培养皿、解剖刀、剪刀、镊子、超净工作台、高压灭菌锅、水浴锅等实验仪器：- 培养室- 电子分析天平- 橡皮筋等四、实验步骤1. 材料预处理：- 将植物叶片用无菌水清洗，去除表面污物；- 用70%乙醇消毒30秒，然后用无菌水冲洗3次；- 用氯化汞（HgCl2）或次氯酸钠消毒5分钟，再用无菌水冲洗3次；- 将消毒后的叶片切成约1cm×1cm大小的块状。

2. 愈伤组织诱导：- 将预处理后的叶片块状接种于MS培养基中；- 在培养室中，将培养皿放置于适宜的温度（25℃左右）和光照条件下； - 观察愈伤组织的形成情况，记录愈伤组织的颜色、质地、大小等特征。

3. 激素配比试验：- 将愈伤组织接种于不同激素配比的MS培养基中；- 观察愈伤组织的生长情况，记录愈伤组织的颜色、质地、大小等特征； - 比较不同激素配比对愈伤组织形成的影响。

4. 再分化培养：- 将愈伤组织接种于含有生长素和细胞分裂素的MS培养基中；- 在培养室中，将培养皿放置于适宜的温度（25℃左右）和光照条件下； - 观察再分化过程，记录芽和根的形成情况。

青蒿茎段愈伤组织的诱导及植株再生施波;孙小琴;任甜甜;石开明;丁莉;周毅峰;周光来【摘要】为了建立青蒿的快速繁殖与遗传育种体系,以青蒿茎段为外植体,研究其离体培养及试管苗再生途径.结果表明,青蒿基段愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA1.0mg·L-1,分化培养为MS+6-BA3.0·L-1+NAA0.5 mg·L-1,生根培养基为MS+NN1.5mg·L-1.【期刊名称】《湖北民族学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2008(026)002【总页数】3页(P217-219)【关键词】青蒿;青蒿素;愈伤;植株再生【作者】施波;孙小琴;任甜甜;石开明;丁莉;周毅峰;周光来【作者单位】湖北民族学院,生物科学与技术学院,湖北,恩施,445000;湖北民族学院,生物科学与技术学院,湖北,恩施,445000;湖北民族学院,生物科学与技术学院,湖北,恩施,445000;湖北民族学院,生物科学与技术学院,湖北,恩施,445000;湖北民族学院,生物科学与技术学院,湖北,恩施,445000;湖北民族学院,生物科学与技术学院,湖北,恩施,445000;湖北民族学院,生物科学与技术学院,湖北,恩施,445000【正文语种】中文【中图分类】R931.21.1 材料青蒿植株由恩施州农业科学研究所青蒿种植基地提供.1.2 方法(1)培养基:以MS为基本培养基，附加蔗糖30 g·L-1，琼脂7 g·L-1，pH调至5.8.由6-BA与NAA激素的不同浓度配制成诱导培养基、分化培养基和生根培养基，121℃高温灭菌20min［9］.(2)取青蒿幼嫩茎段(距顶端1～3 cm处)，用水冲洗30min，在超净工作台上用75%乙醇漂洗1min，转入5%次氯酸钠溶液中浸泡20min，无菌水冲洗4～5次. (3)将无菌外植体剪切成0.5～1.0 cm长的小段，接种在诱导培养基上无菌培养.培养条件为25±1℃，光照1500～2000 lux，每天光照14 h.10 d后观察愈伤组织形成的情况.(4)青蒿愈伤组织分化.将青蒿愈伤组织切成0.5 cm见方的小块分别接种在不同激素浓度的分化培养基上.培养条件为25±1℃，光照1500-2000 lux，每天光照14h.分别观察不同时间的培养后愈伤组织的分化情况.(5)青蒿试管苗的生根.将生长较好的试管苗切成带1～2个节的茎段，转接于生根培养基中，培养条件同上.11 d后观察试管苗的生根情况.2.1 愈伤组织的诱导本研究利用MS与不同浓度的激素(6-BA与NAA)组合培养基，对青蒿茎段愈伤组织进行诱导，生长10 d后进行结果统计(见表1).6-BA浓度的增加有利于青蒿茎段愈伤组织的诱导，但随浓度增至2.0mg·L-1时，出现了较严重的褐化现象，不利于青蒿愈伤组织的进一步分化;NAA浓度的增加对青蒿愈伤组织的诱导率没有太大的影响，但随浓度增至1.5mg·L-1时，产生的愈伤组织普遍细小，说明高浓度的生长激素不利于愈伤组织的产生.从3号培养基诱导的愈伤组织可以看出，愈伤组织较疏松，产生量大，颜色鲜艳，且只有局部褐化，故3号培养基(MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1)为最佳诱导培养基.2.2 愈伤组织的再分化将最佳诱导培养基产生的愈伤组织转接于分化培养基上，产生不定芽的情况见表2. 从表2中可以看出，适当提高6-BA浓度更利于愈伤组织的分化，当浓度达到3.5mg/L(6-BA∶NAA=7∶1)时，产生不定芽数量有所下降，说明细胞分裂素与生长素的浓度比过高反而不利于愈伤组织的分化.培养一周后，3号培养基(MS+6-BA3.0+NAA0.5)产生的不定芽，顶尖呈白色，基部呈淡绿色，且长势也很好，说明3号培养基为最佳的分化培养基.将分化出的不定芽切成带少量愈伤组织的小芽继代培养，观察发现，芽基部继续分化出许多不定芽，8天后长出许多小叶片.再经两周的培养，芽分化成丛生苗，叶片较密，颜色鲜绿，生长旺盛，由此可以看出，青蒿不定芽在3号培养基(MS+6-BA3.0+NAA0.5)上扩繁也较快.2.3 试管苗的生根将上述试管苗切分成若干单株，接种在生根培养基上进行培养.研究表明:青蒿试管苗较容易生根.11 d后统计生根情况如表3所示.由表3可以看出:NAA浓度的适当增加和6-BA浓度的减小有利于试管苗的生根，但当NAA浓度达到2.0mg/L时，根系较细，而3号培养基(MS+NAA1.5)的生根情况最好，生长很快且根系粗壮，更适用于遗传学的研究，故此培养基为最佳生根培养基.本文以青蒿幼嫩茎段为外植体，采用常规的培养基、激素和消毒剂，进行了愈伤组织的诱导、分化和生根等一系列研究.由结果可以看出，青蒿茎段产生愈伤组织与以青蒿子叶和花序等材料为外植体来诱导愈伤组织条件略有不同.王梦琼［10］以青蒿花枝为外植体，以MS+6-BA1.0+2，4-D0.5培养基诱导愈伤组织，并以MS+IAA0.1+KT1.0和MS+IAA0.1+6-BA1.0+NAA1.0培养基分别分化出芽及根;杨耀文［11］等以幼嫩花序为外植体，分别在MS+6-BA8+IAA10、MS+6-BA1.5+IAA0.2、1/2MS+IAA0.5+NAA0.5培养基上分化苗及生根;张伟华［12］用带腋芽的嫩茎和叶片为外植体，在MS+6-BA0.5+2.4-D1.5的培养基上诱导愈伤组织，诱导率分别为86%和100%.本研究表明:青蒿茎段在MS+6-BA1.0+NAA1.0培养基上诱导愈伤组织，在MS+6-BA3.0+NAA0.5培养基上分化与扩繁，在MS+NAA1.5培养基上生根.基于青蒿茎段来源丰富，取材方便，易消毒，成本低等优点，利用茎段为外植体进行组织培养，克服了以青蒿子叶、花序等材料为外植体诱导愈伤组织过程中的消毒时间不易掌控、愈伤不易分化等难题，并且在较短时间内就可获得大量分化良好的愈伤组织以及健壮的根系，为青蒿的快速繁殖提供了基础平台，更为青蒿的遗传分析、育种改良等研究提供了优良的基础材料.［1］钟国跃，周华蓉，凌云，等.黄花蒿优质种质资源的研究［J］.中草药，1998，29(4):264-266.［2］刘春朝，王玉春，欧阳藩.青蒿素研究进展［J］.化学进展，1999，11(1):4l-47.［3］中国中医药信息杂志通讯员.世界卫生组织呼吁中国增加青蒿素产量［J］.中国中医药信息杂志，2005，12(8):110.［4］穆胜玉，白志川，宋孝霞.青蒿组织培养体系建立的研究［J］.重庆科技学院学报，2006，8(4):21-24，35.［5］赵兵，王玉春，欧阳藩，等.生物合成青蒿素及其衍生物研究概况［J］.中药材，1998，21(12):639-642.［6］Alain Goossens，Suvit.Häkkinen，Into Laakso，et al.Secretion of secondarymetabolites by ATP-binding cassette transporters in plant cell suspension cultures［J］.Plant Physiol，2003，131:1161-1164.［7］耿飒，叶和春，李国风.中药青蒿的生理生化特征及研究进展［J］.应用与环境生物学报，2002，8(1):90-97.［8］Fulzele D P，Sopahimalarn AT，Heble MR.Tissue Cultures ofArtemisia Annua:Organogenesis and Artemisinin Production［J］.Phytother Res，1991，5:149-153.［9］周光来.湖北贝母愈伤组织诱导条件的研究［J］.湖北民族学院学报:自然科学版，2004，22(4):39-41.［10］王梦琼.青蒿的组织培养厦植株再生［J］.北京中医药大学学报，2004，27(2):74-75.［11］杨耀文，李保军，张廷襄.黄花蒿组织培养的初步研究［J］.云南中医学院学报，2001，24(2):8，19.［12］张伟华.不同激素组合影响黄花蒿快速繁殖的初步研究［J］.长春理工大学学报，2006，2(4):169-171.【相关文献】［1］钟国跃，周华蓉，凌云，等.黄花蒿优质种质资源的研究［J］.中草药，1998，29(4):264-266.［2］刘春朝，王玉春，欧阳藩.青蒿素研究进展［J］.化学进展，1999，11(1):4l-47.［3］中国中医药信息杂志通讯员.世界卫生组织呼吁中国增加青蒿素产量［J］.中国中医药信息杂志，2005，12(8):110.［4］穆胜玉，白志川，宋孝霞.青蒿组织培养体系建立的研究［J］.重庆科技学院学报，2006，8(4):21-24，35.［5］赵兵，王玉春，欧阳藩，等.生物合成青蒿素及其衍生物研究概况［J］.中药材，1998，21(12):639-642.［6］Alain Goossens，Suvit.Häkkinen，Into Laakso，et al.Secretion of secondarymetabolites by ATP-binding cassette transporters in plant cell suspension cultures［J］.Plant Physiol，2003，131:1161-1164.［7］耿飒，叶和春，李国风.中药青蒿的生理生化特征及研究进展［J］.应用与环境生物学报，2002，8(1):90-97.［8］Fulzele D P，Sopahimalarn AT，Heble MR.Tissue Cultures of ArtemisiaAnnua:Organogenesis and Artemisinin Production［J］.Phytother Res，1991，5:149-153. ［9］周光来.湖北贝母愈伤组织诱导条件的研究［J］.湖北民族学院学报:自然科学版，2004，22(4):39-41.［10］王梦琼.青蒿的组织培养厦植株再生［J］.北京中医药大学学报，2004，27(2):74-75.［11］杨耀文，李保军，张廷襄.黄花蒿组织培养的初步研究［J］.云南中医学院学报，2001，24(2):8，19.［12］张伟华.不同激素组合影响黄花蒿快速繁殖的初步研究［J］.长春理工大学学报，2006，2(4):169-171.Induction of Callus from Stem Segment of Artemisia annua L.and Plant Regeneration。

植物组织培养由于离体植物组织培养对研究植物的形态发生、器官发生、植株再生、植株脱病毒等十分有利，而且植物组织培养理论基础的建立多是以离体组织为研究对象的，因此，组织培养在整个离体培养研究中占有十分重要的地位。

一、植物分生组织培养植物分生组织培养是指对植物的分生组织进行离体培养的技术，包括植物根尖、茎尖等顶端分生组织和形成层组织的培养。

分生组织细胞具有持久的分裂能力和很强的生命力，离体培养时易发生细胞分化，再生完整植株，并利于获得无病毒植株。

在分生组织培养中，以茎尖培养的研究最为深入，广泛用于植株再生和脱病毒等研究。

因此，以茎尖培养为例，说明分生组织培养。

茎尖培养是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。

茎尖培养的材料可以是10～100μm的茎尖分生组织，也可以是几十毫米的茎尖或更大的芽。

植物带芽茎段经严格灭菌后，在超净工作台上将茎段置体视显微镜（放大倍数为8～40倍）下，用尖头镊子固定芽基，用解剖针剥去所有外层鳞片或幼叶，露出生长点后，用解剖针切取所需茎尖。

茎尖大小视要求而定，由于茎尖培养的成活率及分化生长能力与茎尖大小呈正相关，故不可取材过小。

一般脱毒苗的茎尖要求小于1mm，快速繁殖的茎尖可取数毫米。

如从感染大丽花花叶病的植株上切取0.2～0.3mm的茎尖进行培养，获得了无病毒大丽花苗。

茎尖组织经适当培养后，可能发育的方向为：①芽萌发；②产生胚状体；③产生不定器官；④形成愈伤组织。

茎尖组织培养后向哪个方向发育，与茎尖组织的大小、培养条件、特别是培养基中植物生长调节剂的种类和浓度密切相关。

一般外植体微小或为分生组织时，趋向于形成胚性愈伤组织或非胚性愈伤组织，如甘薯外植体取自枝尖生长点时，胚性愈伤组织的诱导频率为55%～60%，取自2、3节位时为35%，4、5节位时为0～25%，6节位以下为0。

茎尖培养常用的培养基为MS基本培养基，其他添加物和植物生长调节剂种类及浓度随培养植物的种类而异，但应避免使用2，4-D，因它常促使外植体愈伤组织化。

姜黄愈伤组织再生体系的建立张施君;刘念;盛爱武;吴国江【期刊名称】《北方园艺》【年(卷),期】2012(000)006【摘要】以姜黄无菌芽的芽基为外植体,进行愈伤组织的诱导和无菌苗再生的研究.结果表明:在MS培养基中添加2,4-D或2,4-D与6-BA的激素组合能够诱导外植体的切口部位产生愈伤组织,但愈伤生长缓慢；在2,4-D和6-BA的激素组合中再加入TDZ,愈伤组织能够不断增殖生长:在MS+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/LBA+0.3 mg/L 2,4-D培养基中,愈伤的诱导率和生长量最高,诱导率达到80％,每个月愈伤生长量为148.6mg；愈伤组织再分化出芽的适宜培养基为MS+0.5 mg/L TDZ+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA,再分化率为90％,外植体的平均出芽数为5.1.当试管苗长至5cm时出瓶移栽,成活率可达90％以上.【总页数】3页(P96-98)【作者】张施君;刘念;盛爱武;吴国江【作者单位】仲恺农业工程学院园艺与园林学院,广东广州510225;仲恺农业工程学院园艺与园林学院,广东广州510225;仲恺农业工程学院园艺与园林学院,广东广州510225;华南植物园,广东广州510650【正文语种】中文【中图分类】S567.23+9【相关文献】1.不同品种谷子种子愈伤组织再生体系的建立 [J], 尹艺臻; 马春英; 王晓璐; 王玉玲; 温银元; 原向阳; 赵娟2.马铃薯晋薯16号愈伤组织再生体系的建立 [J], 牛瑜琦;孙蕾;梅超;王慧杰;宋倩娜;冯瑞云3.中药防风愈伤组织培养及再生体系建立研究现状 [J], 陈鑫;张东向4.全寄生植物分枝列当愈伤组织的诱导及再生体系建立 [J], 董雪;姚兆群;曹小蕾;田芳;赵思峰5.小果卫矛愈伤组织诱导及植株再生体系的建立 [J], 袁云香因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。