愈伤组织的诱导和培养

愈伤组织的诱导形成及分化第五章愈伤组织的诱导、形成及分化第⼀节愈伤组织的诱导、形成及特点⼀、愈伤组织的诱导和形成愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的⽆特定结构的组织。

经⼀段时间的⽣长和增殖以后，在其内部出现⼀定程度的分化，产⽣出⼀些具有分⽣组织结构的细胞团、⾊素细胞或管状分⼦。

植物外植体在培养基和外界环境的作⽤下，经过⼀个复杂的过程形成愈伤组织，即：外植体＋培养基＋环境愈伤组织愈伤组织的形成⼀般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图4.1）。

图4.1 愈伤组织的形成特点1. 诱导期愈伤组织诱导期⼜称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂⽅向和代谢⽅式，合成代谢活动加强，⼤量合成蛋⽩质和核酸物质，为细胞分裂做准备。

诱导期的长短因植物种类、外植体的⽣理状态和外部因素⽽异，即使是同⼀种物种不同基因型同⼀外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。

有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），⽽有的植物诱导期需要数天（胡萝⼘）。

刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h ，但经贮藏5个⽉后，诱导期延长为2天。

2. 分裂期外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发⽣分裂，细胞脱分化。

愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜⾊浅⽽透明（见图4.2）。

分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。

⼩麦幼胚分裂期分裂期分化期分化期图4.2 ⼩麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期（东北农业⼤学⼩麦研究室，李⽂雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）愈伤组织进⼊分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和⽣理状况⽽有很⼤差异。

烟草、胡萝⼘等的脱分化很容易，⽽⽲⾕类则较难；花器官脱分化较易，茎叶较难；幼茎组织脱分化较易，⽽成熟的⽼组织较难。

进⼊分裂期的愈伤组织，如仍在原来的培养基上继续培养，某些愈伤组织将不可避免地发⽣分化，产⽣新的结构，但将其及时转移到新鲜的培养基上（继代培养），则愈伤组织可⽆限制地进⾏细胞分裂增殖，维持不分化的状态。

植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师资料植物愈伤组织诱导培养实验实验目的：1.掌握植物愈伤组织的诱导和培养技术；2.了解植物生长素和植物生长调节因子的作用；3.实践动手能力，培养分析问题、解决实际问题的能力。

实验步骤：1.实验材料种子：芸苔、小麦、玉米等试剂：琼脂、SD综合培养基、激素溶液、酒精灯、移液管等2.种子的表面消毒取适量的芸苔种子，用70%的酒精灯烧消毒。

将种子放入无菌蒸馏水中浸泡20分钟，再用三次含酸性消毒液（NaClO）洗涤。

洗涤后，用无菌蒸馏水洗三次，并将水倒掉。

将种子放在干净、无菌的滤纸上晾干。

3.愈伤组织诱导3.1 试剂配制将SD综合培养基和激素溶液按体积比例配制成诱导培养基。

激素溶液的配方参考如下：IAA：千叶素：6-BA的比例为 10：1：1，浓度为0.108 mg/L；3.2 培养陈列室准备工作实验室必须具有无菌灯、搅拌器、制冷箱或培养箱等基本的实验设备。

实验前清洗设备，使用高压蒸汽或酒精灯等方式灭菌。

在无菌条件下制备琼脂、移液管、培养瓶等。

在实验操作台上，用70%的酒精清洗双手，并用无菌纸巾擦拭干净。

3.3 培养基的制作制好的培养基分装到15ml的培养瓶中。

琼脂用70%酒精擦拭干净，均匀铺在实验平台上，用于接种组织。

3.4 组织接种将种子放在培养基上，用无菌铁丝按一定距离排列成一排。

取出种子，切成0.5-1cm的暴露在外的子叶或幼芽，然后在接种组织区域按照一定距离进行均匀排列。

将培养瓶密封，并放在指定的温度下生长。

4．实验结果的处理和分析4.1 愈伤组织的诱导情况观察家哈的发育情况，如出现愈伤组织的形成，记录其在构型，大小等。

4.2 理化指标的测定在诱导完成后的期间，测定愈伤组织中的蛋白质含量，葡萄糖含量，游离氨基酸含量等指标。

注意事项：1.实验过程中要注意操作技巧，避免污染；2.在培养过程中，要注意温度和光照的控制；3.进行实验时，要做好实验记录和实验数据分析工作；4.实验后，要注意实验设备的清洁和归档。

实验1 愈伤组织的诱导1、实验目的（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法；（2）了解接种的无菌操作技术；（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。

2、实验原理植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。

如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。

由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。

3、实验仪器和试剂仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。

无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。

植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。

试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。

培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.84、实验步骤（1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。

（2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。

（3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。

以下操作全部在无菌条件下进行。

（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。

（5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。

在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。

实验一植物愈伤组织诱导实验一、实验目的1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。

2、培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。

二、实验原理植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。

植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。

而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。

植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。

超净工作台原理：本工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备室内空气→预过滤器(初滤) →小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器(精滤) →出风面吹出洁净气流(具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境三、仪器试剂培养皿及培养架、光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、解剖刀、弯头镊子、剪子、100ml烧杯、培养皿（或不锈钢浅盘）、封口膜、棉线、橡皮筋、次氯酸钠（或HgCl2）、MS 培养基全部试剂、植物激素及生长调节物质、无水乙醇、工业酒精、胡萝卜四、实验步骤（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。

（2）将植物体用自来水冲洗后,用酒精棉擦拭欲取材部位表面, 或于70%酒精中浸沾数秒钟。

（3）将材料放入已灭菌的100ml烧杯（或试剂瓶）中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。

（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。

（5）弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。

（6）将已灭菌的植物材料置于灼烧后冷却的金属盘中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散，以绿豆为材料时，将绿豆纵切或横切，去皮后分别接种。

第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。

大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。

愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。

一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。

细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。

持续十几小时~几天。

2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。

3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。

若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。

2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。

颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。

一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。

3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。

迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。

其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。

生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。

二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。

愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。

烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立一、概述烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，是植物组织培养领域中的一项重要研究。

烟草作为一种重要的经济作物，其组织培养技术的研究对于提高其生产效率、优化品质具有重要意义。

愈伤组织的诱导是植物组织培养的第一步，也是后续细胞悬浮培养、基因工程操作等的基础。

烟草愈伤组织的诱导，通常通过无菌操作，利用激素等生长因子刺激烟草叶片等外植体细胞脱分化形成。

这一过程不仅受到激素种类和浓度的影响，还受到光照、温度、湿度等培养条件的影响。

优化诱导条件，降低褐化等不利因素的影响，是烟草愈伤组织诱导研究的关键。

细胞悬浮培养体系的建立，则是进一步将愈伤组织转化为可用于大规模生产和基因操作的细胞悬浮液。

通过选择适当的培养基、调节生长条件、优化细胞悬浮密度等手段，可以实现烟草细胞的稳定增殖和高效表达。

本文旨在探索烟草愈伤组织的诱导条件以及细胞悬浮培养体系的建立方法，通过系统的实验设计和优化，为烟草组织培养技术的发展和应用提供理论基础和实践指导。

这一研究也将为其他植物的组织培养提供有益的参考和借鉴。

1. 烟草愈伤组织诱导与细胞悬浮培养体系的重要性烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，在植物组织培养、基因工程以及植物快繁等多个领域都具有重要的科学意义和实践价值。

愈伤组织的诱导是植物组织培养中的关键环节。

通过特定的培养基和培养条件，可以诱导烟草叶片等外植体脱分化形成愈伤组织。

这一过程不仅验证了植物细胞的全能性，而且为后续的细胞悬浮培养提供了适宜的起始材料。

细胞悬浮培养体系的建立为植物细胞的大规模培养和遗传转化提供了平台。

通过优化悬浮培养条件，可以获得大量生长状态良好的细胞，进而用于后续的基因转化、次生代谢产物生产等研究。

悬浮培养体系还可以用于筛选具有优良性状或抗性的细胞株系，为烟草育种提供新的途径。

烟草愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系在植物快繁方面也具有潜在的应用价值。

通过诱导愈伤组织再分化形成不定芽或胚状体，可以在短时间内获得大量的植株，从而实现烟草的快速繁殖。

水稻愈伤组织的诱导实验报告
实验目的：
通过诱导方法获取水稻愈伤组织，为后续的基因转化等实验打下基础。

实验材料和设备：
水稻种子、MS培养基、2,4-D溶液、NaClO溶液、无菌操作
器材、显微镜等。

实验步骤：
1.种子消毒：将水稻种子放入1% NaClO溶液中浸泡10分钟，再用去离子水洗净后，放进无菌操作室中。

2.种子发芽：将消毒后的种子放进含有营养的MS培养基中，
在25℃下进行光照培育。

3.愈伤组织诱导：将发芽后的幼苗从培养基中取出，用无菌水
清洗。

将茎部和叶片等不同部位的组织嫁接在含有2,4-D溶液
的MS培养基上，培养在25℃下、光照下，观察诱导组织的
生长情况。

4.分离愈伤组织：当组织生长到一定大小后，用无菌操作器材
将组织用无菌剪刀分离下来。

5.愈伤组织培养：将分离出的愈伤组织放入含有NAA、BA、MS培养基中进行培养。

结果分析：
在诱导的茎部和叶片等不同部位，均出现了白色愈伤组织的诱导生长。

经过分离和培养，得到了纯化的愈伤组织。

通过显微镜观察发现，愈伤组织的细胞间隙变窄，胞间质增多，中心细胞数量增多，细胞核增大，一些细胞内的小器官也出现转化现象。

结论：
通过2,4-D溶液的诱导方法，可以在水稻幼苗的不同部位诱导出白色愈伤组织，愈伤组织的分离和培养也取得了成功。

实验结果为后续的基因转化、基因工程等实验提供了基础。

愈伤组织的形成过程愈伤组织从单个细胞或⼀块外植体形成典型的愈伤组织，⼤致要经历三个时期：⼀、诱导期－细胞准备恢复分裂的时期。

处在静⽌状态的成熟细胞通过⼀些刺激因素和激素的诱导作⽤，使其合成代谢活动加强，迅速进⾏蛋⽩质和核酸物质的合成。

细胞⼤⼩变化不⼤。

诱导原理：静⽌细胞是具有分裂潜⼒的，只是被存在着的⼀类抑制剂所抑制，如果除去抑制物质，就可恢复分裂能⼒。

这些抑制物质的作⽤是阻碍DNA复制，若加⼊抵消抑制剂影响的物质，那么细胞就⽴即进⾏DNA复制，全部细胞进⼊合成期，并发⽣同步分裂。

⼆、分裂期指细胞通过⼀分为⼆的分裂，不断增⽣⼦细胞，即发⽣脱分化的过程。

特点：1．细胞的数⽬迅速增加。

胡萝⼘培养7天后，细胞数可增加10倍。

2．每个细胞平均鲜重下降。

这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数⽬的增加快的缘故。

3．⼦细胞具体积⼩，内⽆液泡的特点，和根茎尖的分⽣组织细胞⼀样。

4．细胞的核和核仁增⼤到最⼤。

5．细胞中 RNA含量减少，⽽DNA含量保持不变。

6．组织的总⼲重、蛋⽩质和核酸含量逐渐增加，新细胞壁的合成极快。

此时愈伤组织的形态特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。

三、分化期细胞停⽌分裂，内部发⽣⽣理代谢变化，导致细胞在形态和⽣理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。

主要特征：1．细胞分裂部位和⽅向发⽣改变。

分裂期的细胞分裂局限在组织的外缘，主要是单周分裂；在分化期开始后，愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢，直⾄停⽌。

愈伤组织内部深处的局部地区的细胞开始分裂，使分裂⾯的⽅向改变了，出现了瘤状结构的外表和内部分化。

2．分⽣组织瘤状结构和维管组织的形成。

当愈伤组织⽣长速度减慢时，就形成由分⽣组织组成的瘤状结构，它变成不再进⼀步分化的⽣长中⼼，⽽在其周缘产⽣扩展的薄壁细胞。

瘤状结构团团地散布在愈伤组织块中。

这时形成了维管组织，但不形成维管系统，⽽呈分散的节状和短束状结构，它可单由⽊质部组成，也可由⽊质部、韧⽪部乃⾄形成层组成。

愈伤组织培养一、外植体的选择愈伤组织培养的第一步是选择适当的外植体。

外植体可以是植物的根、茎、叶、花、果实等任何部分，但必须具有分生能力。

通常，选择新鲜、健康的幼嫩组织作为外植体，因为这些组织分生能力强，容易诱导出愈伤组织。

同时，外植体的选择还必须考虑其遗传背景、生理状态以及是否容易进行消毒等。

二、愈伤组织的诱导外植体在适当的培养基和条件下，能够被诱导形成愈伤组织。

这个过程涉及到细胞的脱分化，即细胞从特定的组织类型转变成未分化的状态。

为了成功诱导出愈伤组织，需要使用含有足够营养物质和植物生长调节物质的特殊培养基。

例如，高浓度的生长素和细胞分裂素可以促进细胞分裂和组织形成。

三、愈伤组织的增殖诱导出的愈伤组织需要在适合的培养基中进一步增殖。

这个过程需要持续监控并调整培养基的成分，以确保愈伤组织能够快速、健康地生长。

同时，还需要控制培养条件，如温度、光照、湿度等，以提供最佳的生长环境。

四、细胞分化的诱导增殖后的愈伤组织可以进行进一步的分化。

这个过程可以通过改变培养基的成分或添加特定的生长调节物质来实现。

例如，某些激素可以诱导愈伤组织分化成特定的组织或器官。

五、遗传稳定性的维持为了保持愈伤组织的遗传稳定性，通常需要进行长期的培养和多代的筛选。

这个过程可以通过定期检查染色体数目和结构来实现，以确保细胞的遗传稳定性。

同时，通过定期进行克隆繁殖，可以进一步维持细胞的遗传稳定性。

六、培养基的选择与优化愈伤组织培养的成功与否，很大程度上取决于培养基的选择和优化。

培养基是愈伤组织获取营养的来源，必须含有细胞生长所需的各类营养物质，如碳源、氮源、维生素、矿物质等。

同时，还需要添加植物生长调节物质，如生长素、细胞分裂素等，以调节细胞的生长和分化。

对于不同的外植体和实验目的，可能需要选择不同的培养基。

例如，MS、N6、B5等都是常用的培养基配方。

此外，培养基的pH值、渗透压等也需要进行适当的调整。

为了优化培养基，通常需要进行一系列的试验和筛选，以找到最适合特定组织或细胞的培养基配方。

实验四植物叶片愈伤组织的诱导培养（理论）一、概念愈伤组织（callus）◆自然状况下指植物在受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。

◆植物组织培养中，指在人工培养基上由外植体组织增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁细胞。

二、植物愈伤组织及形成过程外植体形成愈伤组织，标志着植物组织培养的开始。

1、形态结构◆形状不规则，结构疏松◆有大量的分生中心◆细胞排列毫无次序◆内有大量的细胞间隙◆颜色不一致优良的愈伤组织所具备的特性：A、高度的胚性或再分化能力，以便从愈伤组织得到再生植株B、易散碎，可建立优良的悬浮体系，并可分离出全能性的原生质体C、旺盛的自我增殖能力，可建立大规模的愈伤组织无性系D、经过长期继代保存而不丧失胚性，可进行各种遗传操作2、愈伤组织形成过程A、诱导期◆细胞准备分裂◆合成代谢活动加强◆细胞大小基本不变诱导期时间长短因植物种类、外植体生理状况及外部因素而异B、分裂期◆一分为二，不断增殖◆形态结构与生理生化发生变化主要表现：◆数目迅速增加◆细胞平均鲜重下降◆细胞体积小◆核与核仁增至最大◆ RNA减少，DNA保持不变◆组织总干重、蛋白质与核酸含量增加◆新细胞壁合成极快C、形成期细胞经诱导、分裂形成无序结构愈伤组织的时期。

细胞特点：◆大而不规则、高度液泡化◆无次生细胞壁与胞间连丝◆整个组织松散◆表面以下约5~10个细胞生长中心本时期的愈伤组织是最适合获得单细胞或原生质体的，是建立悬浮体系的最好时期。

D、分化期停止分裂的细胞发生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。

本期愈伤组织特点：◆细胞分裂部位由表层转变到深层◆分裂方向由单周分裂变为深层局部分化◆分化组织瘤状结构形成◆维管组织形成瘤状结构的出现使愈伤组织逐渐形成具有维管组织，呈分散的节状结构形成，出现各类组织细胞。

细胞分裂素对促进维管化组织有重要作用3、愈伤组织的继代培养◆长期保存愈伤组织的一种方法◆直径到2~3cm时与外植体分离，单独培养◆选取其生长迅速的部位作继代培养◆分化与再生植株时，应选生长较慢的愈伤组织◆每一继代培养时间取决于其生长速度◆一般可在3~6周继代一次三、植物愈伤组织的遗传变异1、引起异质性的原因A、外植体染色体倍数性与遗传组成不同的细胞经诱导后的分裂B、培养条件引起的不规则性它们常同时发挥作用2、初生愈伤组织接种到培养基上后，细胞核内的变化：A、正常有丝分裂B、先核内复制，后有丝分裂C、先核碎裂，后有丝分裂◆初生愈伤组织的异质细胞群体性反映了外植体中的染色体状况反映了愈伤组织诱导期间核变异的结果◆在诱导中，会出现二倍体、多倍体、单倍体、非整倍体与染色体结构变异体等3、建成愈伤组织◆选择作用的结果◆只有一种主要核型占优势◆培养基成分和培养类型的影响◆异质群体中细胞间的竞争与互作的影响四、影响因子及培养条件1、培养基2、组织原有的倍数性3、培养环境的条件五、愈伤组织的发生方式发生方式：1、器官发生指细胞或愈伤组织通过形成不定芽再生成植株的过程。