实验四 愈伤组织诱导与继代培养

班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223愈伤组织的诱导和培养一、实验目的及意义植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。

通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。

二、实验原理植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。

如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。

由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。

植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。

三、实验仪器与药品超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗四、实验步骤1.按下表分别配制培养基将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。

洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。

进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。

3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。

取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。

4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况五、实验结果组织长芽，而当生长素含量大于细胞分裂素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定根，也可形成愈伤组织，细胞色素沉淀情况严重；NAA为植物生长素，6-BA为细胞分裂素，促进扦插生根，而当细胞分裂素含量大于生长素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定芽，此次实验由于温度非形成愈伤组织的最适温度，所以未形成完整的愈伤组织细胞团。

玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代研究玉米是世界上最重要的粮食作物之一，其种植面积广泛且产量丰富。

玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代研究是玉米生物技术领域的重要课题之一。

通过对玉米幼胚愈伤组织的诱导和继代研究，可以探索出更高效的育种方法和遗传改良技术，提高玉米的产量和品质，满足人们日益增长的粮食需求。

玉米幼胚胚性愈伤组织诱导是指通过特定的生物技术手段，将玉米幼胚转变为可再生愈伤组织的过程。

幼胚是玉米胚芽在初期生长阶段的胚胎组织，其具有高度的再生和分化潜能，是进行愈伤组织培养的重要材料。

愈伤组织是由植物细胞再生和分化而成的一种特殊组织，具有再生植物的能力。

通过对玉米幼胚的愈伤组织诱导，可以获得大量的再生植株，为玉米的育种工作提供了丰富的遗传资源。

在玉米幼胚胚性愈伤组织诱导过程中，外源激素的添加是至关重要的。

生长素和细胞分裂素等植物激素可以促进幼胚的再生和愈伤组织的形成，而激素的种类和浓度则会对愈伤组织的形成和再生植株的数量产生重要影响。

外界环境条件如光照、温度和培养基的配方也对玉米幼胚的愈伤组织诱导起着重要作用。

通过优化外源激素的添加和培养条件的调节，可以提高玉米幼胚胚性愈伤组织的诱导效率，为后续的遗传改良工作奠定良好的基础。

在玉米幼胚胚性愈伤组织诱导获得后，继代的研究也是十分重要的。

通过对愈伤组织的继代培养，可以获得更多的再生植株，并对其进行进一步的性状分析和遗传改良。

在愈伤组织的继代培养过程中，继代频率、植株再生率和遗传稳定性是评价指标的重要因素。

通过对这些指标的调查和分析，可以评估出最佳的继代培养条件，提高再生植株的质量和数量。

除了对玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代的研究，还可以开展对再生植株的性状和遗传改良的工作。

通过对再生植株的性状的观察和分析，可以筛选出具有优良表现型的植株，为玉米的选育工作提供可靠的遗传资源。

也可以利用基因工程技术对再生植株进行遗传改良，引入抗病虫害基因或提高产量和品质相关基因，从而提高玉米的抗逆性和经济效益。

实验四、愈伤组织的继代与分化培养一、实验目的学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。

二、实验原理愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。

通常，生长素/细胞分裂素比值低利于芽的分化，高则利于根的分化。

将外植体或愈伤接种到激素配比适宜的培养基上培养，可以通过器官发生或体胚发生途径获得再生植株。

三、实验用品器皿与设备同前；用实验三培养的甜瓜/烟草愈伤或子叶外植体，分化培养基（老师准备，同实验三）。

四、实验内容及操作方法注意：四人一组，每组2-3瓶培养基；挑选培养物量大或者培养基少的优先转接。

1）超净工作台等准备工作：同前。

2）将三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。

如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。

3）封好瓶口，标好姓名和接种日期。

4）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。

五、观察记载内容与实验报告1、观察记载内容每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。

每隔3天观察一次。

2、实验报告1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：可用流程图表示 4）实验结果与分析A. 描述培养物的变化及其形态特征；B. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。

再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。

说明：实验报告每人一份，实验结果与分析如有抄袭，涉者均按不及格论处。

综合性实验报告胡萝卜肉质根愈伤组织诱导及继代增殖培养一、实验原理及目的（一）实验目的1、通过MS培养基母液的配制和保存，掌握配制于保存培养基母液的基本技能。

2、通过MS固体培养基的配制，掌握培养基的制备基本技能。

3、学会和掌握诱导愈伤组织的基本技术。

4、初步掌握组织培养的无菌操作技术。

5、初步掌握外植体的消毒技术。

6、掌握组培室常用的化学试剂。

7、学会和掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。

（二）实验原理1、配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。

2、在自然情况下，根主要为植物吸收和固定的重要器官，同时，有些植物的根亦具有繁殖的功能。

植物根生长快、代谢能力强、变异小，使得其在研究根的营养吸收、生长和代谢的变化规律、器官分化、形态建成规律等方面具有重大的理论与实践意义。

依据细胞全能性原理，即指任何具有完整细胞核的细胞（动物、植物等），都拥有形成一个完整个体所必需的全部遗传信息（DNA）。

就胡萝卜根来说，其肉质根细胞同样具有形成完整再生植株的能力。

这种由单个根衍生而来并经继代培养而保存的，在遗传上具有一致的根的培养物，称为离体根无性系。

利用这些离体根的无性系可以进行器官再生体系、苗木无性系快速繁殖和其他方面的实验研究。

3、愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。

它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。

在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木于接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木与接穗沟通。

在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。

其发生过程是：外植体的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁细胞组织而形成愈伤组织。

植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师资料植物愈伤组织诱导培养实验实验目的：1.掌握植物愈伤组织的诱导和培养技术；2.了解植物生长素和植物生长调节因子的作用；3.实践动手能力，培养分析问题、解决实际问题的能力。

实验步骤：1.实验材料种子：芸苔、小麦、玉米等试剂：琼脂、SD综合培养基、激素溶液、酒精灯、移液管等2.种子的表面消毒取适量的芸苔种子，用70%的酒精灯烧消毒。

将种子放入无菌蒸馏水中浸泡20分钟，再用三次含酸性消毒液（NaClO）洗涤。

洗涤后，用无菌蒸馏水洗三次，并将水倒掉。

将种子放在干净、无菌的滤纸上晾干。

3.愈伤组织诱导3.1 试剂配制将SD综合培养基和激素溶液按体积比例配制成诱导培养基。

激素溶液的配方参考如下：IAA：千叶素：6-BA的比例为 10：1：1，浓度为0.108 mg/L；3.2 培养陈列室准备工作实验室必须具有无菌灯、搅拌器、制冷箱或培养箱等基本的实验设备。

实验前清洗设备，使用高压蒸汽或酒精灯等方式灭菌。

在无菌条件下制备琼脂、移液管、培养瓶等。

在实验操作台上，用70%的酒精清洗双手，并用无菌纸巾擦拭干净。

3.3 培养基的制作制好的培养基分装到15ml的培养瓶中。

琼脂用70%酒精擦拭干净，均匀铺在实验平台上，用于接种组织。

3.4 组织接种将种子放在培养基上，用无菌铁丝按一定距离排列成一排。

取出种子，切成0.5-1cm的暴露在外的子叶或幼芽，然后在接种组织区域按照一定距离进行均匀排列。

将培养瓶密封，并放在指定的温度下生长。

4．实验结果的处理和分析4.1 愈伤组织的诱导情况观察家哈的发育情况，如出现愈伤组织的形成，记录其在构型，大小等。

4.2 理化指标的测定在诱导完成后的期间，测定愈伤组织中的蛋白质含量，葡萄糖含量，游离氨基酸含量等指标。

注意事项：1.实验过程中要注意操作技巧，避免污染；2.在培养过程中，要注意温度和光照的控制；3.进行实验时，要做好实验记录和实验数据分析工作；4.实验后，要注意实验设备的清洁和归档。

第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。

大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。

愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。

一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。

细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。

持续十几小时~几天。

2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。

3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。

若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。

2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。

颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。

一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。

3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。

迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。

其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。

生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。

二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。

愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。

玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代研究
玉米是世界上最重要的经济作物之一，其幼胚作为玉米生长的开始阶段，具有很大的
潜力。

玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代研究是对玉米幼胚发育和再生的关键环节进行深
入研究，对玉米的育种和遗传改良具有重要意义。

在研究玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代过程中，首先需要收集优质的玉米种质资源，通过表型观察、遗传分析、分子标记等技术手段对玉米种质资源进行筛选和鉴定。

然后，
利用体外培养技术，将幼胚组织转移到含有适当营养物质的培养基中，利用激素等外源物
质诱导幼胚组织形成胚性愈伤组织。

接着，将诱导形成的愈伤组织进行继代培养，促进其
生长和分化。

在继代培养的过程中，需要对培养条件进行优化，如光照、温度、激素浓度
等因素的调节，以促进愈伤组织的生长和再生。

对再生植株进行鉴定和评价，筛选出具有
优良性状的植株，为玉米的遗传改良和育种提供重要的育种材料。

玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代研究的意义在于，首先可以为玉米遗传改良提供新
的途径。

通过诱导胚性愈伤组织形成再生植株，可以实现对玉米性状的遗传改良，并加快
育种进程。

可以为玉米的组织培养和再生技术提供重要的理论和实践经验。

通过对玉米幼
胚的诱导和继代过程进行深入研究，可以为其他作物的再生和育种提供借鉴和参考。

在实际应用中，玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代研究可以结合现代生物技术手段，
如基因编辑技术、转基因技术等，实现对玉米重要性状的改良和转化。

可以为玉米产业的
可持续发展提供新的技术支撑和人才支持。

本科学生综合性实验报告
学号姓名
学院生命科学学院专业、班级
实验小组及成员
实验课程名称植物组织培养实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2011 至2012 学年下学期填报时间2012 年 6 月 1 日
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案
二．实验报告
1．实验现象与结果
A实验结果记录表：
愈伤组织诱导结果：
总接种瓶数5瓶总接种块数15块
污染瓶数4瓶污染块数11块
未污染瓶数1瓶未污染块数4块
未污染块中愈伤组织发生块数3块
愈伤组织发生率75%
愈伤组织发生情况记录愈伤组织的色泽较新鲜，但比较少
污染情况及原因分析污染瓶中，有1 瓶是霉菌污染，3瓶细菌污染。

可能是接种过程中接种器械消毒不够，掀开封口
膜时碰到了封口膜里面，也可能是封口膜没绑好。

愈伤组织继代培养结果：
继代培养没有受到污染，愈伤组织增殖情况较好，呈现不规则状。

颜色浅黄，注意看会有一些小黑点，愈伤组织开始老化，部分开始分化。

B实验结果图片。

一、实验目的1. 掌握植物组织培养的基本原理和方法。

2. 学习胡萝卜愈伤组织的诱导、继代培养和细胞悬浮培养技术。

3. 了解胡萝卜体细胞胚胎发生培养的过程。

二、实验原理植物组织培养技术是利用植物细胞的全能性，通过人工控制培养条件，使植物细胞或组织在体外发育成完整植株的技术。

胡萝卜愈伤组织诱导、继代培养和细胞悬浮培养是植物组织培养技术中的重要环节。

三、实验材料与仪器材料：- 胡萝卜- MS培养基- 营养液- 消毒剂- 玻璃器皿- 移液器- 高压蒸汽灭菌器- 恒温培养箱四、实验步骤1. 胡萝卜外植体消毒- 将胡萝卜洗净，切成小块，用70%酒精消毒30秒，然后用无菌水冲洗3次。

- 将消毒后的胡萝卜小块接种于MS培养基中。

2. 愈伤组织诱导- 将接种后的胡萝卜小块放入恒温培养箱中培养，温度控制在25℃左右，光照时间为12小时/天。

- 观察胡萝卜小块的愈伤组织形成情况。

3. 愈伤组织继代培养- 将形成的愈伤组织转移到新的MS培养基中进行继代培养。

- 继代培养过程中，每隔一段时间更换一次培养基。

4. 细胞悬浮培养- 将继代培养后的愈伤组织切成小块，接种于营养液中。

- 将接种后的细胞悬浮培养于恒温培养箱中，温度控制在25℃左右，光照时间为12小时/天。

- 观察细胞悬浮培养过程中细胞生长和繁殖情况。

5. 胡萝卜体细胞胚胎发生培养- 将细胞悬浮培养获得的细胞转移到新的培养基中进行胚胎发生培养。

- 观察胚胎发生培养过程中胚胎的形成情况。

五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导- 在适宜的培养条件下，胡萝卜小块逐渐形成愈伤组织。

2. 愈伤组织继代培养- 经过继代培养，愈伤组织数量增加，体积增大。

3. 细胞悬浮培养- 细胞悬浮培养过程中，细胞生长和繁殖良好，形成了大量悬浮细胞。

4. 胡萝卜体细胞胚胎发生培养- 胚胎发生培养过程中，部分细胞形成了胚胎，进一步发育成胡萝卜植株。

六、实验结论1. 通过本实验，成功诱导了胡萝卜愈伤组织。

实验四植物叶片愈伤组织的诱导培养（理论）一、概念愈伤组织（callus）◆自然状况下指植物在受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。

◆植物组织培养中，指在人工培养基上由外植体组织增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁细胞。

二、植物愈伤组织及形成过程外植体形成愈伤组织，标志着植物组织培养的开始。

1、形态结构◆形状不规则，结构疏松◆有大量的分生中心◆细胞排列毫无次序◆内有大量的细胞间隙◆颜色不一致优良的愈伤组织所具备的特性：A、高度的胚性或再分化能力，以便从愈伤组织得到再生植株B、易散碎，可建立优良的悬浮体系，并可分离出全能性的原生质体C、旺盛的自我增殖能力，可建立大规模的愈伤组织无性系D、经过长期继代保存而不丧失胚性，可进行各种遗传操作2、愈伤组织形成过程A、诱导期◆细胞准备分裂◆合成代谢活动加强◆细胞大小基本不变诱导期时间长短因植物种类、外植体生理状况及外部因素而异B、分裂期◆一分为二，不断增殖◆形态结构与生理生化发生变化主要表现：◆数目迅速增加◆细胞平均鲜重下降◆细胞体积小◆核与核仁增至最大◆ RNA减少，DNA保持不变◆组织总干重、蛋白质与核酸含量增加◆新细胞壁合成极快C、形成期细胞经诱导、分裂形成无序结构愈伤组织的时期。

细胞特点：◆大而不规则、高度液泡化◆无次生细胞壁与胞间连丝◆整个组织松散◆表面以下约5~10个细胞生长中心本时期的愈伤组织是最适合获得单细胞或原生质体的，是建立悬浮体系的最好时期。

D、分化期停止分裂的细胞发生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。

本期愈伤组织特点：◆细胞分裂部位由表层转变到深层◆分裂方向由单周分裂变为深层局部分化◆分化组织瘤状结构形成◆维管组织形成瘤状结构的出现使愈伤组织逐渐形成具有维管组织，呈分散的节状结构形成，出现各类组织细胞。

细胞分裂素对促进维管化组织有重要作用3、愈伤组织的继代培养◆长期保存愈伤组织的一种方法◆直径到2~3cm时与外植体分离，单独培养◆选取其生长迅速的部位作继代培养◆分化与再生植株时，应选生长较慢的愈伤组织◆每一继代培养时间取决于其生长速度◆一般可在3~6周继代一次三、植物愈伤组织的遗传变异1、引起异质性的原因A、外植体染色体倍数性与遗传组成不同的细胞经诱导后的分裂B、培养条件引起的不规则性它们常同时发挥作用2、初生愈伤组织接种到培养基上后，细胞核内的变化：A、正常有丝分裂B、先核内复制，后有丝分裂C、先核碎裂，后有丝分裂◆初生愈伤组织的异质细胞群体性反映了外植体中的染色体状况反映了愈伤组织诱导期间核变异的结果◆在诱导中，会出现二倍体、多倍体、单倍体、非整倍体与染色体结构变异体等3、建成愈伤组织◆选择作用的结果◆只有一种主要核型占优势◆培养基成分和培养类型的影响◆异质群体中细胞间的竞争与互作的影响四、影响因子及培养条件1、培养基2、组织原有的倍数性3、培养环境的条件五、愈伤组织的发生方式发生方式：1、器官发生指细胞或愈伤组织通过形成不定芽再生成植株的过程。