曲张链菌素生产菌壮观链霉菌NRRL 2494遗传操作体系的 …

曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL 2494遗传操作体系的建立宋姣姣1，康前进2，张连茹1，吴莹莹1*，白林泉2（1.厦门大学生命科学学院，天然产物源靶向药物国家地方联合工程实验室，福建厦门361005；2. 上海交通大学生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实验室，上海200040）摘要：曲张链菌素属于安莎类抗生素，具有显著的生物活性．在从壮观链霉菌NRRL 2494的发酵产物中分离和鉴定了多组分曲张链菌素的基础上，探索和优化了外源DNA通过接合转移进入壮观链霉菌NRRL 2494的操作方法和培养条件．以游离型质粒pJTU1278为载体，在体外构建了一个曲张链菌素酰胺合酶基因svaF敲除的质粒，通过接合转移转入到壮观链霉菌NRRL 2494野生型菌中，所获得的svaF基因缺失突变株失去了产曲张链菌素的能力．该遗传操作体系的成功建立和优化，使得在体内分析和鉴定曲张链菌素生物合成基因的功能成为可能，同时也为建立其他类似放线菌的遗传操作体系提供了参考．关键词：壮观链霉菌；遗传操作体系；曲张链菌素；生物合成；酰胺合酶中图分类号：Q 933 文献标志码：A放线菌所产生的次级代谢产物是天然活性物质的重要来源．曲张链菌素（streptovaricin）属较早发现的安莎类抗生素，其组分A-E由Siminoff[1]和Ravina等[2]于1957年从壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）NRRL 2494的发酵产物中首先分离，其中streptovaricin A和C 的基本化学结构在1968年得到纯化和鉴定[3]．此后，科学家们还从其他壮观链霉菌株中先后分离和鉴定了组分F, G, K, J, U等数个曲张链菌素的同系物[4-5]，发现这些化合物都有共同的芳香核-萘醌环（图1）．对曲张链菌素的生物合成进行初步研究发现，其以3-氨基-5-羟基苯甲酸（3-amino-5-hydroxybenzoic acid，AHBA）为前体，经I型聚酮合酶（polyketide synthase I, PKS I）催化的10步缩合反应延伸完成聚酮脂肪长链，最终形成大环内酰胺结构并释放[6]，这一聚酮链骨架的化学结构和合成过程与著名的抗结核临床药物利福霉素相同．基金项目：国家自然科学基金项目（31100027）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20110121120013）．*通信作者：wuyingying@图1 曲张链菌素的化学结构式Fig.1 Chemical structures of streptovaricins由于曲张链菌素具有抑制RNA聚合酶和反转录酶（DNA聚合酶）的活性[7-9]，目前已发现其对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和非结核分枝杆菌如堪萨斯分支杆菌（Mycobacterium kansasii）、鸟杆菌（Mycobacterium avium）等都有显著的抗菌活性[10-11]，并有抗病毒活性和优于环孢菌素A的免疫抑制功能[4]，但由于毒性较大而较少使用．随着合成生物学的学科发展和技术创新，通过组合生物合成的策略对目标抗生素进行结构优化成为可能[12-14]。

基于曲张链菌素良好的药物开发前景，我们试图发掘生物活性更好的新结构类似物并增加其产量，从而适合工业化开发．成功建立抗生素产生菌的遗传操作体系是对抗生素进行生物合成研究和结构改造的前提，但关于壮观链霉菌的遗传操作体系目前还未见报道．本文以曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL 2494菌株为对象，在了解其抗生素敏感性和生长速度快等特点的基础上，发现了缩短常规结合转移时间和使用半营养培养基等方法对结合转移的促进作用，成功实现了对曲张链菌素生物合成基因的敲除突变．该遗传操作体系的建立为进一步研究曲张链菌素的生物合成奠定了基础．1 材料与方法1.1 材料1.1.1菌株和质粒产生曲张链菌素的壮观链霉菌NRRL 2494，用于结合转移的游离型质粒载体pJTU1278[15]，作为阿泊拉霉素抗性基因来源的质粒pJTU472[16]由上海交通大学微生物代谢国家重点实验室构建并保存；构建克隆用载体pBluescript II SK（+）和宿主菌大肠杆菌（Escherichia coli）Top10，结合转移的质粒供体大肠杆菌ET12567/pUZ8002[17]均由本实验室保存．1.1.2 培养基LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母抽提物5，NaCl 10，pH 7.0.TSBY培养基（g/L）：TSB （Trypticase Soy Broth）30，酵母抽提物10，蔗糖103，pH 7.2.SFM培养基（g/L）：黄豆饼粉20，加入1 L自来水灭菌后用四层纱布过滤，再加入甘露醇20，pH 7.5.高氏一号培养基（g/L）：可溶性淀粉20，NaCl 0.5，KNO3 1，FeSO4 0.001，K2HPO4 0.1，MgSO4.7H2O 0.5，pH 7.2. Waksman培养基（g/L）：（NH4）2SO40.2，K2HPO3.3H2O 3.0，MgSO4.7H2O 0.5，CaCl2.7H2O 0.126，pH 7.2．壮观链霉菌NRRL 2494发酵培养基ZM [4]（g/L）：黄豆饼粉10，葡萄糖25，酵母粉2.5，氯化钾4，K2HPO4 0.1，硫酸铵5，牛肉浸膏1，碳酸钙3．ISP2和ISP3培养基配方见参考文献[18]．以上对应的固体培养基加入20 g琼脂．1.1.3 酶和主要试剂酶类和DNA marker购自TaKaRa公司，DNA回收试剂盒购自OMEGA公司，质粒回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司，其他常规试剂均为国产分析纯级产品，各种抗生素购自国内试剂公司，使用浓度为氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/mL，氯霉素（chloramphenicol）25 mg/mL，卡那霉素（kanamycin）25 mg/mL，硫链丝菌素（thiostrepton）10 mg/mL，阿泊拉霉素（apramycin）30 mg/mL，萘啶酮酸（nalidixic acid）25 mg/mL，制霉菌素（nystatin）25 mg/mL．PCR引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成，DNA测序由上海立菲公司完成．1.2 方法1.2.1 壮观链霉菌NRRL 2494的抗生素敏感性检测采用SFM培养基，配制包括氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、硫链丝菌素、阿泊拉霉素、链霉素和萘啶酮酸在内的7种抗生素系列浓度平板，浓度分别为1，5，20，和50 mg/L．取新鲜的菌丝体划线展开于各个抗生素浓度梯度的固体平板上，置于28 °C培养箱中培养，从第3天开始至第7天进行生长情况观察．1.2.2 酰胺合酶基因svaF敲除重组质粒pWY5的构建壮观链霉菌NRRL 2494的基因组DNA参考文献[19]的方法进行快速提取．根据所获得酰胺合酶基因片段的DNA序列，在基因svaF的左右两侧各1100 bp处分别设计两对引物，分别是左同源臂SvaFLF：5’-AAAGGTACCGGCTCAGGGACGCCACCA-3’（引入Bam HI 酶切位点）和SvaFLR：5’-AAAAAGCTTGTCCGGCGACTGGGCGACA-3’（引入Hin dIII酶切位点）；右同源臂SvaFRF：5’-AAAAAGCTTGTCCTGCGCCGCGCCGTTGT-3’（引入Hin dIII 酶切位点）和SvaFRR：5’- AAAGGATCCGCCAGTCGCAGGGGAGCGG-3’（引入Kpn I酶切位点）．以曲张链菌素野生型产生菌NRRL 2494的基因组DNA为模板，分别以上述两对引物进行PCR，扩增出两侧同源交换臂片段，根据两端带有的限制性内切酶位点分别进行双酶切，将这2个片段与经同样处理后的pBluescript II SK（+）载体连接，构建重组质粒pWY1．测序验证后以KpnI和BamHI酶切pWY1，回收2.2 kb包含双臂序列的片段，与经过相同酶处理的载体pJTU1278连接，构建重组质粒pWY4．用Hin dIII酶切质粒pJTU472，回收1.4 kb左右含有转移原点ori T和阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV的Hin dIII片段，连接至同样经Hin dIII处理过的pWY4上，构建最后用于基因置换的质粒pWY5．将pWY5转化到E. coli ET12567/pUZ8002中，构建E. coli ET12567/pUZ8002/pWY5，作为接合转移的供体菌．1.2.3 大肠杆菌和壮观链霉菌NRRL 2494的接合转移实验供体菌E. coli ET12567/pUZ8002/pWY5在6 mL含有相应工作浓度的卡那霉素、氯霉素、阿泊拉霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中于37 °C生长至OD600值约0.4~0.6时，离心收集菌体（3220 g，10 min），用LB洗涤菌体2~3次后，重悬于1 mL LB培养基中，作为接合转移的供体菌．受体壮观链霉菌NRRL 2494于SFM固体培养基上生长120 h，将孢子收集到TES buffer中，充分震荡并过滤后以3220 g离心5 min去除上清，将孢子重悬于5 mL TES buffer中，50 °C热激10 min，冷却后加入等体积的预萌发液，37 °C培养萌发2.5 h，3220 g 离心10 min收集菌体，悬浮于10 mL的LB液体培养基中，作为接合转移的受体菌．将上述供体菌和受体菌分别进行显微计数，按大肠杆菌细胞与链霉菌孢子数量相当的比例各取相应体积的悬液混合均匀，涂布于不含任何抗生素的半营养SFM固体培养基上，吹干，置于37 °C培养8 h后用1 mL含有30 μg /mL阿泊拉霉素和25 μg /mL萘啶酮酸的无菌水均匀覆盖整个平板，吹干表面水分后置于28 °C培养，大约3~5 d后可观察到结合子．1.2.4 壮观链霉菌NRRL 2494双交换突变株的获得接合转移平板上长出的接合子分别影印到含有硫链丝菌素和阿泊拉霉素的SFM固体培养基上，28 °C培养3-5天后，选取对硫链丝菌素敏感而对阿泊拉霉素不敏感的菌株，提取基因组DNA，以阿泊拉霉素的抗性基因引物Apr-F（5’-GCTCA TCGGTCAGCTTCTCA-3’）和Apr-R（5’-TCGCA TTCTTCGCA TCCC-3’）进行扩增．为进一步验证该突变株，在所敲除基因序列的上下游设计一对检测引物（MTF：5’-ACCACCTCA TGGCGATCCCGTACAAC-3’和MTR：5’-GCTGTGCGGTGAGTTCGTGCGGTT-3’），利用PCR结果来判断接合转移子的基因型（单交换或双交换突变株）．1.2.5 壮观链霉菌野生型及其突变株的发酵和产物分析曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL 2494或其突变株接种于SFM固体培养基上，28 °C培养6 d后，刮取孢子接种于ZM液体培养基中，28 °C、220 r/min摇床培养68~72 h．按照培养物：培养基比例为1：50的接种量转接于新鲜的ZM液体培养基中，28 °C、220 r/min 继续培养5 d，得到曲张链菌素产生菌及其突变株的液体发酵物．发酵液经离心，调上清pH 到7.0，加等体积的乙酸乙酯提取两次，菌丝体经丙酮浸泡24 h，过滤、减压浓缩至无丙酮水溶液，乙酸乙酯萃取两次．合并乙酸乙酯萃取液，用旋转蒸发仪得到浓缩物样品，溶于500 µL的甲醇中，进行高效液相色谱（HPLC）检测．检测条件为：流动相A相为100%纯水，流动相B为100%甲醇；流速为0.6 mL/min，检测波长为254 nm．梯度洗脱程序：0~6 min，20%~75% B相；6~10 min，75% B相；10~15 min，75%~95% B相；15~20 min，95% B相；20~22 min，95%~20% B相，22~37 min，20% B相．2 结果和分析2.1 壮观链霉菌NRRL 2494菌株的抗生素敏感实验为了确定壮观链霉菌遗传操作系统所需的遗传筛选标记，我们检测了NRRL 2494菌株对多种抗生素的敏感性．结果表明，NRRL 2494菌株对卡那霉素、阿泊拉霉素和硫链丝菌素较为敏感，而对氨苄青霉素、氯霉素、链霉素和萘啶酮酸都表现出不同程度的抗性（表1）．据此结果，我们选择阿泊拉霉素作为NRRL 2494突变株的筛选标记，并将萘啶酮酸作为接合转移实验中大肠杆菌的抑制剂．表1 壮观链霉菌NRRL 2494菌株对不同抗生素的敏感性Tab. 1 The sensitivity of S. spectabilis NRRL 2494 to various antibiotics抗生素抗生素使用浓度氯霉素+ + -/+卡那霉素-/+ - -阿泊拉霉素- - -硫链丝菌素-/+ - -链霉素+ -/+ -萘啶酮酸+ + +注：-，未生长；-/+，弱生长；+，正常生长2.2 壮观链霉菌与大肠杆菌接合转移实验方法和条件的摸索大肠杆菌-链霉菌间的接合转移方法由于条件温和、操作方便和菌株稳定，是目前遗传操作中最常用的方法[20]．鉴于NRRL 2494菌株生产的孢子比较丰富，我们选择利用菌株的孢子通过接合转移的方法来探索壮观链霉菌NRRL 2494菌株的遗传操作体系的建立．首先，为收集大量孢子以进行遗传操作，我们采用了SFM、ISP2、ISP3、ISP4和waksman 5种固体培养基对NRRL 2494菌株进行了培养，发现其在SFM平板上的产孢情况最佳，故选用SFM作为NRRL 2494的产孢培养基．其次，链霉菌孢子的质量和数量是影响接合转移成功与否的关键因素，因此，采用插片法观察菌株NRRL 2494在SFM培养基上生长的菌丝和孢子的形态，并应用血球计数板对孢子进行计数，结果显示培养24 h后NRRL 2494开始产生少量孢子，48 h后开始产色素，而96-120 h孢子形态和数量达到最佳状态，168 h后孢子开始呈现老化状态，因此选取120 h作为孢子收集的时间．鉴于NRRL 24946较其它种属链霉菌更快的生长速度，我们在接合转移实验中设置了一系列供体菌与受体菌的接合时间梯度，由常规链霉菌使用的12~20 h缩短到6~14 h，发现结合时间在8 h左右效果最好．也正是基于生长速度快的特点，我们采用完全SFM和半营养SFM培养基进行接合转移实验并比较结果，发现在抗生素覆盖接合转移平板后，完全培养基表面在48 h内就生长出链霉菌菌苔，而半营养培养基上则在3~5 d后出现分散的链霉菌菌落．这个结果说明，完全培养基上链霉菌的生长速度过快，抑制了大肠杆菌的生长，导致结合转移过程受阻；而营养成分减半的培养基控制了链霉菌的生长，保证了大肠杆菌的生长速率，使得大肠杆菌中的外源重组质粒能够进入链霉菌，提高了接合效率．因此，我们选择半营养SFM培养基作为NRRL 2494与大肠杆菌间结合转移筛选培养基．2.3 SvaF基因失活突变株的筛选根据1.2.2节的方法，我们构建了用于NRRL 2494菌株中酰胺合酶基因svaF敲除的重组质粒pWY5，为验证其正确性，将pWY5以Kpn I和Bam HI双酶切，得到9.2和3.6 kb两个片段；用Hin dIII单酶切，得到12.8 kb的单个片段，结果均符合预期（图2）．A. svaF基因失活突变株的构建示意图；B. 重组质粒pWY5的限制性酶切结果：1. 标准DNA分子质量；2. Kpn I和Bam HI双酶切产物；3. Hin dIII单酶切产物．图2 svaF基因失活突变株的构建及pWY5质粒验证Fig. 2 Construction of svaF inactive mutant and confirmation of plasmid pWY5以E. coli ET12567/pUZ8002/pWY5作为供体菌，壮观链霉菌NRRL 2494的孢子作为受体菌进行接合转移，培养3~5 d后，在每个9 cm平板上都有20个以上的接合转移子出现．挑取单菌落分别影印至含有硫链丝菌素的平板和阿泊拉霉素的平板上培养，并对可能的单交交换接合子在无抗性的固体培养基上进行2轮松弛，筛选出4个突变株SW1-2，SW1-3，SW1-10和SW1-12．以这4株菌的基因组DNA为模板，以阿泊拉霉素抗性基因引物Apr-F/Apr-R和检测引物MTF/MTR分别进行PCR扩增．如果是双交换菌株，可得到0.73 kb的阿泊拉霉素抗性基因片段和1.7 kb的验证引物扩增产物；野生型菌株则只能得到1.0 kb的验证引物扩增产物，不含阿泊拉霉素抗性基因．PCR结果表明所得到的4个突变株均为双交换菌株（图3），对验证引物扩增产物的测序结果进一步证明了突变株的正确性．A. 壮观链霉菌NRRL 2494野生型和svaF基因失活突变株中阿泊拉霉素抗性基因的PCR扩增结果：1. 标准DNA分子量；2. NRRL 2494野生型菌株；3. pJTU472；4. SW1-2；5. SW1-3；6. SW1-10；7. SW1-12；B. 壮观链霉菌NRRL 2494野生型和svaF基因失活突变株中检测引物的PCR扩增结果：1. 标准DNA分子量；2. NRRL 2494野生型菌株；3. SW1-2；4. SW1-3；5. SW1-10；6. SW1-12．图3 svaF基因失活突变株的PCR验证Fig. 3 Gel electrophoresis analyses of PCR products from ΔsvaF mutants2.4 SvaF基因失活突变株的发酵产物分析将所获得的双交换突变株进行发酵培养，同时以野生型菌株NRRL 2494作为对照，用高效液相色谱-质谱联用的方法（HPLC-MS）检测发酵产物．结果显示，野生型菌株的发酵产物（图4 A）在保留时间为31.29 和37.6 min时，分别检测到曲张链菌素C组分([M+H]+ (m/z 769.8)，[M+Na]+ (m/z 791.8)；图4 C)和G组分([M+H]+ (m/z 786.4)，[M+Na]+ (m/z 808.3)；图4 D)，而突变株发酵产物（图4 B）未检出相应的质谱数据，即突变株不再产生野生型菌株中的主要曲张链菌素组分streptovaricin C和streptovaricin G. 这说明位于重组质粒pWY5上的外源DNA通过接合转移从大肠杆菌中导入到了壮观链霉菌NRRL 2494中，并发生了预期的同源重组，成功地获得了酰胺合酶基因svaF缺失的双交换突变株．酰胺合酶属于NA T (Arylamine N-Acetyltransferase) 家族，具有保守的Cys-His-Asp三联体活性位点，与聚酮链的释放环化有关[21].由于这些突变株不再产生曲张链菌素的组分，表明酰胺合酶SvaF与曲张链菌素的生物合成相关．A. 壮观链霉菌NRRL 2494野生型菌株，(●)：曲张链菌素C；(☆)：曲张链菌素G；B. svaF基因失活突变株SW1-2；C. 曲张链菌素C的质谱数据；D. 曲张链菌素G的质谱数据.图4 svaF基因失活突变株发酵产物的高效液相色谱-质谱分析Fig. 4 Analyses of fermentation products from ΔsvaF mutants by HPLC-MS3 讨论链霉菌属于放线菌中的最大类群，是一类具有重要经济价值的革兰氏阳性菌，能够产生多种抗生素和生物活性物质．为实现对其生物合成途径及代谢调控的人工控制，需要稳定的遗传操作系统．通过接合转移的方式，链霉菌遗传操作体系的发展相对成熟，但对壮观链霉菌的遗传操作系统仍未见报道．壮观链霉菌能够产生包括大观霉素、曲张链菌素、硝本吡喃酮、巴弗洛霉素等多种抗生素[22]，其中曲张链菌素是一种极具前景的候选药物．因此，建立壮观链霉菌NRRL 2494的遗传操作体系，利用组合生物合成的方法对其改造，有望获得具有良好活性的新型化合物．在常规的放线菌基因敲除实验中，接合转移过程中供体菌和受体菌的接合时间一般都在12 h以上，鲜见低于12 h的报道．我们按照该时间多次尝试NRRL 2494的结合转移，都没能成功获得结合子．插片法观察的结果表明壮观链霉菌NRRL 2494生长速度较普通链霉菌快，因此我们尝试缩短接合时间到8 h，同时使用半营养培养基用作接合转移，最成功建立了外源DNA通过接合转移进入壮观链霉菌NRRL 2494的遗传操作体系，并实现对其所产曲张链菌素的生物合成基因进行体内敲除的遗传操作，获得了曲张链菌素酰胺合酶基因失活的双交换突变株，导致该突变株不再产生曲张链菌素．此外，生物信息学分析表明，该基因与利福霉素生物合成基因簇中的rifF同源性较高，研究表明RifF是利福霉素生物合成中的关键酶，负责安莎聚酮链的释放[23]．我们的实验结果提示了曲张链菌素中的酰胺合酶SvaF在体内具有与RifF相似的功能．综上所述，本研究成功建立了壮观链霉菌NRRL 2494的遗传操作体系，为进一步研究曲张链菌素的生物合成和获取曲张链菌素的新结构类似物奠定了基础，同时也为其他生长速度较快的链霉菌属菌种的相关类似研究提供了参考．参考文献：[1] Siminoff P, Smith R M, Sokolski W T, et al. 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State-Province Joint Engineering Laboratory of Targeted Drugs from Natural Products, Schoolof Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. State Key Laboratory ofMicrobial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao TongUniversity, Shanghai 200240, China)Abstract: In order to enable the streptovaricin biosynthetic study by in vivo gene disruption, it is crucial to develop a genetic modification system for producer Streptomyces spectabilis NRRL 2494. This study aimed to construct the method of conjugation to transfer exotic DNA into Streptomyces spectabilis NRRL 2494. A putative streptovaricin amide synthase gene svaF was disrupted in vivo, and the resulting plasmid was transferred into Streptomyces spectabilis NRRL 2494 by conjugation through a double-crossover recombination event. The svaF gene mutants lost the ability to produce streptovaricin. Based on the above work, we developed a genetic manipulation system for Streptomyces spectabilis NRRL 2494, enabling the functional characterization of streptovaricin biosynthetic genes in vivo, and offered a positive example for other fast-growing Actinobacteria lacking an appropriate genetic manipulation system.Key words: Streptomyces spectabilis; genetic manipulation system; streptovaricin; amide synthase。