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体外诱导兔骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的研究的开题报告一、研究背景和意义随着人口老龄化和生活方式的改变，心血管疾病的发病率不断增加，成为严重威胁人类健康的疾病之一。
平滑肌细胞是心血管系统中的重要组成部分，与血管的收缩和松弛、血压的调节以及血液循环等密切相关。
因此，平滑肌细胞的缺乏或功能异常会导致心血管疾病的发生。
目前，细胞治疗已成为治疗心血管疾病的新途径，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）由于其易得、易扩增、多向分化潜能和免疫调节作用等优点，成为最具潜力的细胞治疗手段之一。
研究表明，BMSCs能够向平滑肌细胞分化，但其分化程度和效果仍有待提高。
因此，本研究旨在探究体外诱导兔BMSCs向平滑肌细胞分化的最佳条件及分化机制，为心血管疾病的治疗提供新的思路和方法。
二、研究内容和方法1. 研究内容（1） BMSCs的提取与鉴定：收集兔骨髓，并通过红细胞溶解液和悬浮培养法提取BMSCs；使用细胞形态学和表面标志物鉴定方法确立BMSCs的特异性。
（2）平滑肌细胞分化条件的筛选：体外诱导BMSCs分化为平滑肌细胞，并通过细胞形态学、分子生物学、蛋白质组学等手段评价分化程度和效果，筛选出最佳的分化条件。
（3）平滑肌细胞分化机制的研究：通过Western blot、Real-time PCR、免疫组化等手段检测与平滑肌分化相关的分子表达变化，探讨平滑肌分化机制。
2. 研究方法（1）实验动物：新西兰白兔。
（2）主要试剂：DMEM/F12基础培养液、FBS、L-Ascorbic Acid、β- glycerophosphate、Dexamethason、Insulin、Fibrinogen、Thrombin等。
（3）实验步骤：BMSCs的提取、平滑肌细胞分化条件的筛选、平滑肌细胞分化机制的研究。
三、研究预期成果（1）筛选出最佳的平滑肌细胞分化条件，提高BMSCs向平滑肌细胞分化的程度和效果。
（2）探究平滑肌细胞分化机制，结合上下游调控因子，探索平滑肌细胞分化的新途径和方法。
间充质干细胞培养上清输注对糖尿病大鼠治疗作用的机制研究庞雅平;程愈;郝好杰;刘杰杰;申晶【摘要】目的观察间充质干细胞(MSCs)培养上清输注对糖尿病大鼠高血糖紊乱的治疗效果,探讨MSCs分泌产物促进胰岛再生的作用机制.方法SD大鼠腹腔单次注射大剂量链脲佐菌素(STZ,65mg/kg)建立糖尿病大鼠模型,将诱导成功的30只糖尿病大鼠随机分为MSCs培养上清治疗组(CM,n=15)、培养基治疗组(M,n=15),分别输注MSCs培养上清、培养基.另将15只正常大鼠作为对照组.连续治疗3d后每日测血糖,于治疗第7天测定血清胰岛素及C肽,并行腹腔糖耐量检查(IPGTT).对动物胰腺组织标本行多重免疫荧光染色,观察MSCs上清治疗后胰岛β细胞再生情况,并进一步探究胰岛细胞再生的可能机制.结果与M组比较,治疗早期(＜7d)CM组糖尿病大鼠血糖降低,血清胰岛素及C肽含量明显增加(P＜0.05).IPGTT结果显示,CM 组较M组糖尿病大鼠胰岛功能明显增强.胰腺组织多重免疫荧光染色提示,CM组糖尿病大鼠的胰岛内β细胞数量较M组明显增加(P＜0.05),但仍少于对照组;β细胞增殖率较M组及对照组均显著提高(P＜0.01).结论MSCs分泌产物通过促进胰岛β细胞增殖,促进胰腺再生,恢复胰岛功能,可用于早期糖尿病的控制与治疗.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2015(040)006【总页数】5页(P449-453)【关键词】间质干细胞;胰岛;再生;胰岛素分泌细胞【作者】庞雅平;程愈;郝好杰;刘杰杰;申晶【作者单位】075000 河北张家口河北北方学院研究生院;100039 北京解放军总医院生命科学院;100039 北京解放军总医院生命科学院;100039 北京解放军总医院生命科学院;100091 北京解放军309医院内分泌科【正文语种】中文【中图分类】R587.1间充质干细胞(MSCs)是一类具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞，在多种疾病中参与受损组织的修复与再生，如心肌梗死[1]、急性肾损伤[2]、创伤[3]等。
（一）项目的意义、必要性和依据近年来大量的研究证实间充质干细胞（MSCs）是骨髓微环境细胞的起源细胞，是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。
MSCs因其具有以下特点而日益受到人们的关注：(1)多向分化潜能：在体内/外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞；(2)造血支持和促植入：作为造血微环境主要细胞成分——基质细胞系的干细胞，MSCs通过细胞对细胞的直接作用、分泌细胞外基质及多种细胞因子，实现对造血的精细调控，支持造血干细胞的生长，与造血干细胞共同移植可促进造血干细胞的植入；(3)免疫调控：MSCs表达MHC-I类分子，不表达CD80，CD86，HLA-DR等协同刺激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主病，诱导器官移植免疫耐受有较好的应用前景。
(4)自我复制：MSCs作为干细胞可以自我复制，体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，在基因治疗中有着十分诱人的前景。
在造血干细胞移植治疗恶性血液病的应用研究促进造血干细胞移植的造血重建：近年来有关MSCs体内、外支持造血，抑制免疫功能的报道有很多，提示MSCs可以作为造血干细胞移植的共移植手段以及应用于临床相关疾病的治疗，可提高造血干细胞移植患者的存活率和移植后生存质量，从而大大提高移植治疗的有效性和适应症，具有良好的应用前景。
MSCs经静脉回输后广泛分布于骨髓、肝脏、脾、胃肠道、肾脏、肺脏及肌肉等器官组织，对受体BM-MSCs来源的检测结果发现，供体来源的MSCs能够定植于受体骨髓。
Maitra等体外扩增人MSCs，与造血干细胞（HSC）共移植给NOD/SCID小鼠，对照研究结果显示，当HSC数量有限时，只有同时给予MSCs输注才能获得更为有效的造血植入。
黄绍良等进行了自体和异基因MSCs联合脐血移植的I期临床试验，结果显示异基因MSCs联合UD-UCBT具有明显促进造血恢复的作用。
两种肝组织匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的比较闫成;薛改;吴丽颖;刘建芳;侯艳宁【摘要】BACKGROUND:Previous studies have demonstrated that normal rat liver homogenate supernatant can induce human umbilical cord mesenchymal stem cels to differentiate into hepatocyte-like cels with partial hepatocyte functions. However, whether fibrotic liver homogenate supernatant can work or how the inducing effect is remains unclear. OBJECTIVE:To investigate the differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cels into hepatocytes under the normal liver and fibrotic liver microenvironment in vitro. METHODS:Liver fibrosis was induced in the SD rats by repeated intraperitoneal injections of 3% thioacetamide at a dose of 200 mg/kg body mass, twice a week for 4 weeks, and then fibrotic liver tissues and normal liver tissues were used to prepare liver homogenate supernatants. Passage 3 human umbilical cord mesenchymal stem cels were used and divided into standard control group (cels were cultured in DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum), fibrotic liver homogenate supernatants group (cels were cultured in DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum and 50 g/L fibrotic liver homogenate supernatants), normal liver homogenate supernatants group (cels were cultured in DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum and 100 g/L normal liver homogenate supernatants). The morphological changes of the cels in each group were recorded under inverted microscope; the proteinlevels of CK18, AFP, CYP3A4, CYP2E1, CYP2D6 and TPH2 were evaluated using western blot assay. Furthermore, the concentration of albumin in the cels was measured. RESULTS AND CONCLUSION:After a 7-day inducement, the stem cels in liver homogenate supernatants groups lost their fusiform shape and changed into hepatocyte-like cels with the morphous of round shape. Compared with the standard control group, the hepatocyte-like cels in the two liver homogenate supernatants groups exhibited human hepatocyte biomarkers, CK18 and AFP. The standard control group cels could express a little amount of CYP2E1, while cels in the two liver homogenate supernatants groups could express CYP3A4, CYP2E1, CYP2D6, TPH2. Compared with the standard control group, the expression level of CYP2E1 in the two liver homogenate supernatants groups increased significantly (P < 0.01), and however, the relative levels of CYP3A4, CYP2E1, CYP2D6, TPH2 in the two liver homogenate supernatants groups showed no statistical significance (P > 0.05). At the same time, compared with the standard control group, the concentration of albumin in the two liver homogenate supernatants groups markedly increased (P < 0.01), but there was no difference between the two liver homogenate supernatants groups (P > 0.05). Experimental findings demonstrated that both of normal liver tissue and fibrotic liver tissue microenvironments could induce human umbilical cord mesenchymal stem cels to differentiate into hepatocyte-like cels. To achieve the same effect, compared with normal liver tissue, fibrotic liver tissue required lower concentrations, suggesting that fibrotic liver tissue microenvironment may be more conducive to differentiation ofumbilical cord mesenchymal stem cels into hepatocytes.%背景:前期研究证明正常大鼠肝组织匀浆上清液可诱导人脐带间充质干细胞定向分化为具有部分肝细胞功能的肝样细胞,而肝纤维化大鼠肝组织匀浆上清液的诱导可行性及与前者诱导效果的比较尚不明确.目的:比较正常肝组织及纤维化肝组织微环境诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的能力.方法:采用腹腔注射3%硫代乙酰胺生理盐水溶液(200 mg/kg,2次/周,共4周)的方法制备SD大鼠肝纤维化模型,取肝纤维化大鼠及正常大鼠肝脏制备肝组织匀浆上清.将第 3 代人脐带间充质干细胞进行分组诱导培养:①标准对照组:加入含体积分数为 10%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基.②纤维化肝组织匀浆组:加入含体积分数为10%胎牛血清及50 g/L纤维化肝组织匀浆的DMEM/F12培养基.③正常肝组织匀浆组:加入含体积分数为10%胎牛血清及100 g/L正常肝组织匀浆的DMEM/F12培养基.诱导开始后于倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化;取标准对照组及诱导7 d的匀浆组细胞采用Western Blot法检测CK18、AFP、CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2的表达情况,采用ELISA法测定各组细胞培养液中白蛋白水平.结果与结论:与标准对照组长梭形成纤维样细胞相比,诱导7 d时,肝纤维化匀浆组及正常匀浆组细胞形态变化明显,呈类圆形,胞体丰满.与标准对照组相比,两匀浆组细胞均可表达肝细胞标志物CK18和AFP.标准对照组细胞可表达少量CYP2E1,两匀浆组细胞表达CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2等肝细胞功能蛋白,且CYP2E1的表达量较标准对照组明显增加(P < 0.01),而两匀浆组间上述蛋白的相对表达量差异无显著性意义(P > 0.05).同时,两匀浆组细胞分泌白蛋白的能力较标准对照组亦明显增强(P < 0.01),两匀浆组相比差异无显著性意义(P > 0.05).实验结果显示正常肝组织和纤维化肝组织微环境均可诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化,在达到相同诱导效果时,纤维化肝组织所需组织液浓度更低,提示纤维化肝组织微环境可能更有利于人脐带间充质干细胞向肝细胞分化.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(019)019【总页数】6页(P2993-2998)【关键词】干细胞;脐带脐血干细胞;肝纤维化;肝组织匀浆上清液;微环境;人脐带间充质干细胞;诱导分化;肝细胞;细胞色素P450酶;白蛋白【作者】闫成;薛改;吴丽颖;刘建芳;侯艳宁【作者单位】解放军医学院,北京市 100853;解放军白求恩国际和平医院药剂科,河北省石家庄市 050082;解放军白求恩国际和平医院药剂科,河北省石家庄市050082;解放军白求恩国际和平医院药剂科,河北省石家庄市 050082;解放军白求恩国际和平医院药剂科,河北省石家庄市 050082;解放军白求恩国际和平医院药剂科,河北省石家庄市 050082【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章亮点：1间充质干细胞治疗肝纤维化的机制之一是其移植入血后可归巢至受损肝组织并向肝细胞分化，促进肝脏修复。
｛；： ；ｌ：基础医学 中国组织工程研究与临床康复第Ｊ２誊第８期２００８—０２—１９出版 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９，２００８ Ｖｏ１．１２．Ｎｏ．８
膀胱匀浆上清液在大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为平滑肌样 细胞中的作用☆
王振显’，蔡文清’，、宋永周 ，瞿长宝’，史正亮 ，郭 威。 Ｒａｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ ｂｌａｄｄｅｒｓ
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Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｄｅｐａｒｔｎｌｅｎｔ ｏｆ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｓｕｒｇｅｒｙ， Ｄｅｏａｒｍａｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ０ｆ Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｍｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓ ｈｉｉｉａｚｈｕａｎｇ ０５Ｏ０５１．Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ； ￣０ａｒｕｎｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ，Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓ ｉｉａｚｈｕａｎｇ ０５００ｌ７．Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎａ
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摘要 目的：环境因素对干细胞的分化起到重要的作用。实验拟观察经低浓度二甲亚枫进行预诱导后，大鼠骨髓间充质干细胞在体 外经膀胱组织匀浆上清液诱导定向分化为平滑肌样细胞的可行性。 方法：实验于２００７—０４１２００７－０９在河北医科大学解剖教研室下属细胞培养室完成。①实验材料：４～６周龄ｌ０ｏ～１５０ ｇ健康清 洁级ＳＤ大鼠１只，雌雄不限，８周龄２２０～２５０ ｇＳＤ大鼠４只，由河北医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置 符合动物伦理学标准。②实验方法：采用骨髓干细胞培养基和贴壁法从ＳＤ大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞，并在体外扩 增、传代。选择８周龄ＳＤ大鼠进行膀胱组织上清液的制备。取第４代骨髓问充质干细胞用１％二甲亚砜预诱导８ ｈ后，应用 膀胱匀浆上清液诱导７ ｄ。以未进行诱导的骨髓问充质干细胞为阴性对照组。③实验评估：观察细胞形态学的变化，并运用免 疫细胞化学检测特异性ａ一平滑肌肌动蛋白（ａ—ＳＭＡ）的表达。 结果：骨髓问充质干细胞经诱导分化后，细胞呈梭形平滑肌样，融合后形成峰谷状排列，并表达平滑肌特异性蛋白标志物ａ
一平滑肌肌动蛋白，诱导分化率为（４５．６±３．５）％，与阴性对照组相比差异具有显著性意义（Ｐ＜０．０５）。 结论：采用此方法成功诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌样细胞。 关键词：干细胞：平滑肌；细胞培养；分化
王振显，蔡文清，宋永周，瞿长宝，史正亮，郭威．膀胱匀浆上清液在大鼠骨髓问充质干细胞诱导分化为平滑肌样细胞中的作 用…．中国组织工程研究与临床康复，２００８，ｌ２（８）：１４２２—１４２５（Ｃｈｉｎａ） 【ＷＷＷ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ／ｚｇｌｃｋｆ／ｅｊｏｕｒｎａｌ／ｕｐｆｉｌｅｓ／０８—８／８ｋ一１４２２（ｐｓ）．ｐｄｆｌ
ＰＯ．Ｂｏｘ１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００４ ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｍｚｃｏｒｎ
维普资讯 http://www.cqvip.com Ｉ振显．等 磅咣匀浆上清液在大鼠骨髓问充囊 细胞诱导分化为平滑驵样细胞中的佟嘲 ｗｗｗ．ｚｇｌｃ ＞＞本文导读＜＜ 课题背景：作着前觐头验 相关鳝务 ：近年来的研究表明，环境因素在干细 应用要篇：骨髓干细胞在体 采用１０％的二甲亚砜联合 胞分化过程中起关键作用．Ｊａｎｇ等应用受损伤的肝 外经诱导可分化为平滑肌细 成纤维细胞生长因子成功 脏组织匀浆与遣血干细胞进行非接触性嵌合培养， 胞．文献报道的诱导剂多为血 的将大鼠骨髓间充质干细 在体外诱导造血干细胞向肝脏Ｅ皮分化过程中细胞 小板衍生生长因子、转录生长 胞诱导为神经元样细胞，但 表面出现肝脏Ｅ皮细胞特异标记的表达。国内杨景 因子以及平滑肌细胞共培养 ７ｈ后细胞即开始死亡，２４ｈ 全等报道，大鼠脊髓匀浆上清液可在体外有效地诱 等．本实验采用首先应用低浓 后大部分细胞已经脱离培 导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞．张婷等也 度的二甲亚砜（Ｉ％ＤＭＳＯ）对 养颓．瓶庶．，说明高浓度化学 报道，在缺缸再灌注损伤大鼠肾脏匀浆诱导下，骨 大鼠骨髓间充质干细胞进行 诱导剂对细胞有毒性作用． 髓干细胞可向肾小管上皮样细胞分化。骨髓间充质 初诱导８ ｈ，然后应用膀胱匀 膀胱匀浆上清不是化学制 干细胞在体内分化为何种细胞，可能受很多因素的 浆上清液再诱导７ｄ，通过改变 剂，而１％二甲亚砜为低浓 影响，其所处微环境的改变、宿主对其的诱导趋 干细胞生存的微环境，成功地 度化学制剂，对细胞均无明 化作用及其可能分泌的某些趋化因子、生长因子 将骨髓间充质干细胞诱导分 显毒性作用． 等可能是很重要的诱导因素。 化为平滑肌样细胞．
