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1、材料
成年小白鼠4只 胎牛血清（杭州四季清公司） L-DMEM (Hyclone赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司 ） 胰蛋白酶（Sigma公司） PBS（NaCl 8g,KCl 0.2g,NaHPO4·12H2O 2.88g,KH2PO4 0.2g,三蒸水1000ml) Percoll细胞分离液（Percoll原液：三蒸水:NaCl 2.6:1.9:0.5) 青霉素、链霉素（100U/ml青霉素，100µg/ml链霉素） 8%NaHCO3溶液（8gNaHCO3,100ml超纯水）
2、仪器
• 倒置显微镜尼康TE2000E（上海于欣仪器有限公司） • CO2恒温培养箱MC0-15A(日本三洋电机楳氏会公司)
• 超净工作台SW-CJ-2F（苏州安泰空气技术公司）
• 生物显微镜（舜宇公司）
• 低温高速离心机（Jouan公司)
• 无菌操作台，血球计数板，6孔培养板等
3、方法
骨髓的收集
图1.倒置显微镜下骨髓间充质干细胞原代培养形态观察 Fig.1 Morphology of BMSCs in primary culture under an inverted microscope (A)1d,×100;(B)3d,×100;(C)5d,×200;(D)7d,×200;(E)9d,×400;(F)13d,×400.
结果二
（二）原代小鼠骨髓MSCs的生长曲线结果
BMSCs原代培养生长曲线（图2），生长曲线表明BMSCs的增殖能力 很强，所测细胞在开始的前4天里生长缓慢处于潜伏适应期，第5 天开始迅速增长进入对数生长期，到第9天细胞数轻度上升，第10 天达到顶点，生长速度减缓进入平台期。
四
讨论
• 分离骨髓MSCs的方法主要有四种：贴壁筛选法、密度梯度离心法、免疫磁 珠分离法、流式分选法等。我们使用密度梯度离心和贴壁筛选法相结合， 能有效地将红细胞、白细胞和间充质干细胞分离开来，同时操作简便，快 速，对细胞的活性影响较小。且此分离法简单经济，因而被广泛应用。 •据本实验培养细胞的经验，如果操作中吸取界面层细胞不小心，会混进非单 核细胞，就会大大降低细胞分离的纯度，使分离出的细胞大小不均。另外， 细胞分离操作时间延长，操作不轻柔，分离出的细胞纯度降低，都会降低细 胞的贴壁率和存活率。
10%胎牛血清最适合MSCs的生长。细胞接种密度过密，会引起细胞之间的接触
抑制；而过稀又会导致细胞分泌的因子不足从而影响细胞的生长。一般适宜 密度为（48）×104个/ml。
五 结论
本实验通过对成年小白鼠骨髓MSCs进行分离，体外培养， 同时从细胞形态和生物学特性进行观察和检测，认为采用淋 巴细胞分离液密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结 合，可以获得纯度较高和活性骨髓MSCs，具有操作简单， 快速，实用等优点，为一种较为有效的分离纯化骨髓 MSCs的方法。
3、骨髓间充质干细胞的应用前景
在适当的条件下，骨髓间充质干细胞可以分化为三个胚层来源的组织细胞 而进行细胞移植的治疗，在体外培养扩增后也可种植于生物材料上，回植 入机体修复组织损伤。 骨髓间充质干细胞在治疗组织器官退行性疾病、遗传缺陷性疾病和基因治 疗方面也展现了美好前景。
二、材Leabharlann Baidu和方法
结果一
第1次换液后5～7 d可见由几十个到数百个细胞组成的集落，细胞形 梭态呈形、三角形或星形 （图1C、D）
结果一
原代细胞培养10 d左右，细 胞快速增殖，每个集落中的 细胞不断增殖呈长梭形放射 状排列（图1E）
培养2周左右，每个小集落形 成约数百致上千个细胞的大 集落，集落交界处出现重叠 、融合 （图1F)
谢谢大家
Percoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细
胞
贴壁培养骨髓间充质干细胞
形态学观察
原代培养细胞
生长曲线的测定
三、结果
（一）骨髓间充质干细胞的形态学观察
24 h后就见有细胞贴壁，多数细 胞呈圆形 （图1A）
72 h后首次半量换液去除未贴壁 细胞，此时贴壁的细胞为单个， 形态大部分为圆形 （图1B)
小鼠骨髓间充质干细胞的原代培 养
一、立题依据
1、小鼠骨髓间充质干细胞原代培养的意义
有利于进行骨髓间充质干细胞的生物学特性的研究
为下一步的传代培养创造条件
可以直接应用于临床实践，是研究骨髓间充质干细胞作用 的前提
2、骨髓间充质干细胞原代培养的方法
贴壁培养筛选法 密度梯度离心法
讨论
• 有时在相同的培养条件下，有极少数标本较难扩增骨髓MSCs，可能与冲洗骨 髓腔的操作有关。骨髓MSCs具有黏附贴塑料瓶壁的特性，在实验中用玻璃瓶 也能培养扩增。在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的MSCs外，还混杂着
一些其他细胞，可以根据这些污染细胞生物学特性将其除去。血清的浓度并
非越高越好，相反，高浓度血清由于含有大量促进细胞分化的因子，已引起 细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而不利于干细胞生长，一般以5%～
