WB实验步骤详解

免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。

WB实验步骤详解Western blotting（简称WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质分离、转移和检测，可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。

本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者了解该技术的操作流程。

1. 细胞培养和蛋白提取。

首先，需要培养细胞并收集细胞样本。

将细胞样本离心，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞。

接下来，加入细胞裂解液并振荡离心，收集上清液，即为蛋白提取物。

2. 蛋白质浓度测定。

使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。

3. SDS-PAGE凝胶电泳。

将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液，然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。

进行电泳分离蛋白质，根据蛋白质大小和电荷不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。

4. 蛋白质转印。

将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。

将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。

5. 阻塞。

将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。

6. 一抗孵育。

加入第一抗体，孵育过夜。

第一抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。

7. 洗涤。

用TBST或PBS洗膜，去除未结合的抗体。

8. 二抗孵育。

加入HRP标记的二抗，孵育1小时。

二抗与第一抗体结合，形成复合物。

9. 洗涤。

用TBST或PBS洗膜，去除未结合的二抗。

10. 显色。

加入ECL显色液，使得膜上的蛋白质产生发光反应。

将膜放入暗室中，用X光片曝光，然后用显影液显影。

11. 图像获取和分析。

将X光片放入X光片扫描仪中，获取蛋白质条带的图像。

使用图像分析软件，如ImageJ，分析蛋白质的相对表达水平。

以上就是WB实验的详细步骤，每一步都至关重要，需要严格按照操作规程进行。

希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程，并在实验中取得准确、可靠的结果。

WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。

它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。

本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。

一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。

具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。

2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。

这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。

3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。

4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。

5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。

6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。

7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。

8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。

9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。

二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。

1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。

b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。

c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。

2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。

b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。

c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。

3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。

wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。

该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。

以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。

首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。

接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。

二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。

2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。

3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。

4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。

5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。

6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。

以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。

WB实验步骤WB实验是一种分离和检测蛋白质的常用实验技术。

以下是WB实验的详细步骤，共分为六个主要步骤。

步骤一：蛋白质提取1.1收集实验所需样本，例如细胞或组织。

如果是细胞样本，可以通过细胞培养离心将细胞沉淀下来。

如果是组织样本，可以通过切割及别的方法收集组织样本。

1.2加入合适的蛋白质提取缓冲液，如RIPA缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性。

1.3震荡或旋转混合样本，使细胞或组织彻底裂解。

1.4将样本在低温下离心，以去除细胞残渣和细胞核等。

1.5收集上清液，其中含有溶解的蛋白质。

步骤二：蛋白质浓度测定2.1 使用BCA蛋白质定量试剂盒或Bradford蛋白质定量试剂盒等试剂，根据试剂盒说明书，测定蛋白质的浓度。

2.2根据蛋白质的浓度调整提取的蛋白质样本的浓度，以保证后续实验的准确性。

步骤三：SDS-电泳3.1准备一定比例的分离凝胶和浓缩凝胶。

通常使用8%-12%的聚丙烯酰胺凝胶。

3.2预运行凝胶，将上清液和蛋白质样本与蛋白负载缓冲液混合，使其达到相同的体积分数，并加入还原剂和SDS。

3.3将混合样品加载到凝胶孔中，根据需要分别加载蛋白质标准，以便确定蛋白质样品的分子量。

3.4设置合适的电泳电压，使蛋白质在凝胶中进行电泳，直至蛋白质通过凝胶前进行分离。

3.5 可以通过染料（如Coomassie blue G-250染色）或银染等方法，可视化分离的蛋白质带。

步骤四：蛋白质转移4.1准备一块聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维膜（NC）作为蛋白质的转移载体，并根据凝胶大小和所需的转移时间切割。

4.2将预运行的蛋白质凝胶和转移载体置于转移装置中，确保凝胶和载体之间没有气泡。

4.3加入冷却的转移缓冲液，确保完全润湿载体，并移除空气泡。

4.4设置合适的转移电流和时间，以将蛋白质从凝胶中转移到膜上。

4.5转移结束后，将膜从转移装置中取出，并立即进行后续处理。

步骤五：免疫检测5.1将膜与阻塞缓冲液溶液处理，以防止非特异性结合。

WB实验基本原理1. 概述WB实验（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，通常用于检测特定蛋白质在样本中的存在与表达水平。

WB实验具有高度的灵敏度和特异性，可以在复杂的混合物中检测目标蛋白质，并测定其相对含量。

本文将介绍WB实验的基本原理和实验步骤。

2. 实验步骤WB实验主要包括以下几个步骤：样本制备首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质样本。

常用的方法是使用细胞裂解缓冲液将细胞或组织完全裂解，并使蛋白质溶于缓冲液中。

裂解过程中最好加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以避免蛋白质降解。

完成裂解后，离心样品并收集上清液，该液体中含有被裂解的细胞或组织的蛋白质。

SDS-PAGE电泳接下来，将蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳进行分离。

SDS-PAGE是一种聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术，通过加入电场使蛋白质在凝胶中沿着电场方向迁移。

在SDS-PAGE过程中，蛋白质样品中的蛋白质会被SDS和还原剂处理，使其在凝胶中以其分子量为依据进行分离。

转膜在蛋白质样品分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白质转移到膜上以进行进一步检测。

通常使用聚氟乙烯（PVDF）或亲水性的聚酰胺（nitrocellulose）膜进行转膜。

转膜过程中，蛋白质会通过电泳方法从凝胶中迁移到膜上形成相应的蛋白质“印迹”。

阻断与孵育转膜完成后，需要对膜进行阻断处理，以避免非特异性结合。

常用的阻断方法是在膜上加入含有非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）的缓冲液，使其与膜上的非特异性结合位点结合，从而阻断不相关的反应。

接下来，将目标蛋白质的特异性抗体加入孵育缓冲液中，并将膜浸入其中进行孵育。

抗体与膜上的目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。

探针标记为了检测膜上的特定蛋白质，探针标记是必需的。

可以使用酶标记的二抗或荧光标记的二抗作为探针，与抗体进行特异性结合。

常见的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP），而常见的荧光标记物有荧光素等。

信号检测与图像分析在探针标记完成后，使用相应的底物进行信号的检测。

WB实验基本步骤WB实验是一种用于检测和分离目标蛋白质的常用技术，它结合了SDS-和免疫学技术。

以下是WB实验的基本步骤：1.样品制备：首先，需要从细胞，组织或培养物中提取目标蛋白质。

提取方法根据样品的性质而异，可以利用细胞裂解和离心来获取细胞和组织提取物，或者将培养物离心并用PBS洗涤来获取培养物提取物。

提取的样品通常需要加入蛋白酶抑制剂和磷酸盐缓冲液以保持目标蛋白质的完整性。

2. 蛋白质浓度测定：使用BCA、 Lowry或Bradford等标准浓度测定方法，测量目标蛋白质在样品中的浓度。

这是为了确保在加载样品到SDS-胶上时，每个样品都包含相等的蛋白质量。

3. SDS-电泳：将样品加入含有SDS和还原剂的Laemmli试剂，然后通过堆积凝胶（通常是12%）和分离凝胶（通常是4-20%梯度凝胶）分离蛋白质。

SDS在SDS-中提供负电荷，使蛋白质带有均等的负电荷，并且还原剂将蛋白质中的二硫键还原为单硫键，使其线性化。

加载的样品和分子量标尺（如预制的蛋白质标尺）通过电流进行电泳，直到达到所需的分离程度。

4.蛋白转移：将胶上的蛋白质转移到聚丙烯酰胺(PVDF)或硝酸纤维素（NC）膜或其他适用于蛋白质转移的膜上。

通常使用半湿式转移方法，其中将凝胶的胶异型架和转移膜浸泡在转移缓冲液中，并将电流应用于构成电泳腔的两侧。

电流通过凝胶和蛋白质，使蛋白质转移到膜上。

5. 蛋白质定位：使用染色方法（如Ponceau S染色或Coomassie蓝染色）将膜上的蛋白质定位。

这个步骤是为了检查蛋白转移的效果以及加载的标尺和样品之间的分离效果。

染色后，可以测量标尺和目标蛋白质的迁移距离，以及标尺和样品之间的大小分离。

6.阻塞膜：将转移膜浸泡在阻塞缓冲液中，通常是在蛋白质标识位点不与抗体结合的蛋白质（如牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉）中。

阻塞的目的是防止未结合的抗体与非特异性蛋白质位点结合。

7.一抗孵育：将目标蛋白质的特异性抗体孵育于阻塞转移膜的缓冲液中。

WB实验步骤详解WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。

在WB实验中，通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来，然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上，并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。

最后，使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。

下面是WB实验的详细步骤：1.提取蛋白质：首先，从细胞、组织样本中提取蛋白质。

这个步骤可以使用不同的方法，例如细胞裂解、组织切碎和离心等。

提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。

2.蛋白质电泳分离：将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。

通常使用的凝胶是SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳），该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。

样品加载完毕后，通电进行电泳分离。

较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部，较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。

3.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。

通常使用的膜是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。

在转印之前，通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。

然后，将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起，将其放置在转印装置中，施加电流进行蛋白质转印。

4.阻断：将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。

阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。

最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。

5.抗体孵育：使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。

首先将抗体稀释在主抗体稀释液中，然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。

通常在4℃下过夜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。

选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。

6.辅助抗体孵育：将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上，用于识别已结合的主抗体。

这些次级抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光染料标记进行共轭，以便于标记的抗体的检测。

次级抗体与主抗体结合形成复合物。

7.检测：使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。

这些方法可以使用酶标法（如辣根过氧化物酶反应和色素显色）或荧光技术（如荧光染料）。

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。

WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。

以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。

A第一部分：蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

方法的选择◆自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取。

Example 1：实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：1.提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。

4.蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。

注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。

5.样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。

具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。

WB实验步骤详解Western blotting (WB)是一种用于检测蛋白质的技术，它可以分析蛋白质的大小、数量和结构。

WB通常用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平，以及蛋白质的修饰状态。

本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者更好地理解和掌握这一技术。

步骤一，细胞或组织的裂解。

WB实验的第一步是将细胞或组织裂解，以释放蛋白质。

通常使用RIPA缓冲液或其它含有蛋白酶抑制剂的裂解液来裂解细胞或组织。

裂解液中的蛋白酶抑制剂可以防止蛋白质在裂解过程中被降解，保证蛋白质的完整性。

步骤二，蛋白质的分离。

裂解后的细胞或组织中含有大量的蛋白质，需要将这些蛋白质分离出来。

通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来分离蛋白质。

SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小将其分离成不同的条带，方便后续的检测。

步骤三，将蛋白质转移到膜上。

分离后的蛋白质需要转移到膜上，以便进行免疫印迹检测。

通常使用半湿式或全湿式电泳转印系统将蛋白质转移到聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜上。

转印的时间和电压需要根据蛋白质的大小和数量来确定。

步骤四，膜的封闭。

转移完蛋白质后，需要将膜进行封闭，以防止非特异性结合。

封闭通常使用5%脱脂奶粉或蛋白质封闭剂进行，可以有效地减少非特异性结合，并提高抗体对目标蛋白的特异性识别。

步骤五，抗体的孵育。

封闭后的膜需要与特异性的一抗进行孵育。

一抗可以是针对目标蛋白的单克隆或多克隆抗体。

孵育时间和温度需要根据抗体的性质来确定，通常在4°C下孵育一晚上。

步骤六，膜的洗涤。

孵育完一抗后，需要对膜进行洗涤，以去除未结合的抗体和非特异性结合。

洗涤液通常是含有Tween-20的PBS或TBST缓冲液，需要进行多次洗涤以确保膜的干净。

步骤七，二抗的孵育。

洗涤完膜后，需要与特异性的二抗进行孵育。

二抗通常是与酶或荧光素结合的抗体，可以识别一抗并发出特定的信号。

孵育时间和温度需要根据二抗的性质来确定。

步骤八，膜的洗涤。