生化大实验
实验报告
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实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取
一、实验原理：
多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。
蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。
二、实验目的：
通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。
三、材料与试剂：
1.材料：马铃薯（两小组共称200g）
2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）
3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机；
四、操作步骤：
1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min；
2.用两层纱布将所得的浆液过滤；
3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min；
4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min；
5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min；
6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。
五、结果和分析：
实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。
六、讨论与结论：
1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化；
2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净；
3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果；
4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
实验2 胰酶分离提取及活性诱导
一、实验原理：
胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶制剂，胰酶的分离提取是普通生化实验的最主要、最经典的实验。
提取胰酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀除去。经此多次提取，最后在pH 8.0硼酸缓冲液中得到结晶。
胰酶在pH 3.0时最为稳定，可在低温下储存较长时间而不失活；低于此pH酶易变性；高于pH 5.0时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程易在低pH和低温下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。
二、实验目的：
本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备样品。
三、材料与试剂：
1.仪器：紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、pH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盘、乳钵，大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、pH试纸，滤纸、玻璃器皿等；
2. 材料：新鲜猪胰脏；
3. 试剂及溶液配制：pH 2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M NaOH溶液、5M NaOH 溶液、0.1M HCl溶液、0.025M HC1溶液、0.01M HCl溶液、0.4M pH 9.0硼酸缓冲液Tris，硫酸铵，0.8M pH 9.0硼酸缓冲液。
四、操作步骤：
1.取新鲜猪胰脏1个冰浴下剥除脂肪和结缔组织，用绞肉机绞碎胰脏；
2.加1-2倍体积已预冷却的pH 2.5-
3.0乙酸酸化水溶液提取(按1g组织相当于1ml体积算)；
3.检查提取液中pH，若高于pH 3.0时应及时用10%乙酸调节，使提取液维持在pH 2.5-3.0之间，在冷室5℃左右搅拌提取18-24h，4层纱布过滤，用50m1 pH 2.5乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为1-2h)合并滤液，用5M H2PO4溶液调正pH至2.5-3.0，过滤，离心30min，取上清，量其总体积；
4.盐析加固体粉状硫酸铵33.9g，至40%饱和度；盐析1h，12000rpm离心10min；
5. 然后上清液加硫酸铵33.3 g，至75%饱和度盐析1h，然后12000rpm离心10min；
6. 沉淀溶于10ml pH
7.5，0.1M Tris，透析过夜，4℃保存。
五、结果和讨论：
1. 经过以上实验步骤得到澄清的酶液。
2. 用新鲜的猪胰脏是因为新鲜的胰脏胰酶含量高，容易分离提取。
3. 提取过程中保持pH值2.5-3.0之间，是因为胰酶在低pH值下没有活性，不会催化其他蛋白的水解从而降低酶的含量。
4. 加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃棒的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白沉淀变性，并注意用量的计算。
实验3 卵清蛋白的分离提取
一、实验原理：
鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1：1。鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量28000，但糖成分上有差别。有四种不同组分，等电点的围为pH 3.9-4.5，280nm的消光系数为A=4.13(1%，1cm)。鸡卵粘蛋白在中性或是酸性溶液中和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。
由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶的强烈抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。
二、实验目的：
掌握鸡卵清蛋白的提取方法和操作步骤，为以后进行自己的实验打下良好的基础。
三、材料与试剂：
1.材料：新鲜鸡蛋2只；
2.仪器：抽滤瓶500-1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器；
3.试剂：10%TCA，5N HCl，5N NaOH，冷丙酮，胰蛋白酶液，BAEE-0.05M，pH 8.0 Tris-HCl 缓冲液，pH 8.0 Tris-HCl缓冲液。
四、操作步骤：
1.取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25-30℃，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积的三氯乙酸-丙酮（1：2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终pH约3.5，在继续搅拌30min，然后在4℃放置过夜；
2.次日进行离心，得黄绿色清液；
3.边搅拌边加入4℃遇冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4℃放置2h之后将上清也小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于10000rpm离心5min，收集沉淀；
4. 将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水透析4h，换水两次，在对碳酸钠缓冲溶液透析过夜，10000rpm离心10min，去除不溶物，取少量上清液；
5. 10000 rpm离心10 min，取上清液。
五、结果和分析：
1.经过上面实验得到了较为纯净的鸡卵粘蛋白，呈白色粉末状。
2. 在离心以后一定要弄清楚是收集沉淀还是上清液，否则实验将会失败。
3. 在实验中要控制pH值，不能使其成碱性，否则粘蛋白会分解，影响粘蛋白的量。
实验4 柱层析纯化PPO
一、实验原理：
柱层析技术是常用的纯化酶、蛋白的手段。在普通生化操作中经常通过离子交换层析和凝胶层析联用实现蛋白质的纯化。
(1)PPO的基团能被离子交换树脂所吸附从而可以把PPO从溶液中分离出来去掉杂蛋白。在用与树脂离子结合强度比PPO大的洗脱液洗脱就可以得到较为纯净的PPO蛋白。
二、实验目的：
1.通过离子交换层析和凝胶色谱层析分离纯化PPO的操作，以期掌握柱层析的基本原理、运用及操作技术，并了解凝胶色谱测定蛋白质分子量的基本原理和操作方法。
三、材料与试剂：
1.材料：实验一所得的PPO粗提液。
2. 试剂：0.02M Tris-HCI缓冲液pH 7.4（含0.001M EDTA）配制时配X10倍浓缩液1000m1；NaCl；聚乙二醇。
3.实验器械与仪器设备：
试管架、烧杯、玻璃棒、移液管、滴管等、试剂瓶、层析柱PH计和pH试纸恒流泵、梯度混合仪。
四、操作步骤：
1. DEAE-纤维素的处理及装柱，按照树脂材料的要求对进行处理，将处理好的材料装入洗净的层析柱，柱材装到离柱上端1.5-2cm时停止。
2. 平衡：柱材装好后柱上端进液口接恒流泵，下端出液口连接蛋白检测仪，用0.02M Tris-HCl 缓冲液对柱材进行平衡，直到仪器的显示数据不再变化为止。
3. 上样：将粗提酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH 7.4洗脱蛋白。
4. 洗脱：用含NaCl的0.02M Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，同时用小试管接洗液，每管接到试管的2/3处。共接收8管。
五、结果和分析：
1.经过柱层析纯化的PPO用1.5ml的离心管收集，每管收集2/3体积。收集液无色。
2.在上样之前一定要平衡好柱子，否则首先洗脱下来的是缓冲液，影响洗脱效率。
3,柱子要竖直，以免柱材料表面不水平，从而影响洗脱
实验5：酶含量和活性测定
一、实验原理：
(1)蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合后会显示不同的颜色，测定其合适波长下的OD值
可以推算出蛋白的含量。
(2)PPO可将酚类物质氧化成有色物质，通过测一定波长的OD值便可以推算出PPO的
含量。
二、实验目的：
掌握酶蛋白含量和活性测定的方法。
三、材料与试剂：
1.材料：
经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶液，DEAE-纤维素DE52分离的酶液和Sephadex G-200分离纯化的酶液样品。
2.仪器与器皿：
分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管和试管、核酸蛋白检测仪；GL-20C高速冷冻离心机，酶标板，酶标仪等。
3.试剂：
考马斯亮蓝G-250蛋白试剂、蛋白标准液；DEAE-纤维素DE52；葡聚糖凝胶Sephadex G-200；兰葡聚糖、葡聚糖-40、70、100等。硫酸铵沉淀组分，DE-52洗脱组分，邻苯二酚，0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液pH 5.8，考马氏亮蓝G-250蛋白试剂，蛋白标准液。
四、操作步骤：
测定酶活性和蛋白浓度，计算纯化倍数。
（1）酶含量测定
依次分别取洗脱下来的8管试液20μl加入到酶标板的2-9孔，第一孔加入20μl洗脱液，第10、11孔加入20μl粗酶及粗酶1。在在所有孔中加入100μl考马氏亮蓝G-250蛋白试剂显色10min，然后用酶标仪测OD值。
（2）酶活性的测定
依次分别取洗脱下来的8管试液20μl加入到酶标板的2-9孔，第一孔加入20μl洗脱液，第10、11孔加入20μl粗酶及粗酶1。再在所有孔中20μl柠檬酸缓冲液，然后加入20μl 邻苯二酚试剂显色10min，然后用酶标仪测OD值。
五、结果和分析
1.凝胶色谱层析纯化PPO：蛋白的含量、酶活、纯化倍数的测定结果
不同试管中蛋白的显色后的OD值：