向日葵黑茎病病原菌分离鉴定及快速检测体系的建立

向日葵黑茎病和茎溃疡病菌生物学特征、分子检测及检疫处理向日葵是我国重要的油料作物之一,具有较高的营养价值。

近几年,我国不断的从国外引进向日葵种子,种子上携带的多种危险性病害传入我国的风险加大。

其中向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii和茎溃疡病菌Diaporthe helianthi是两种重要的检疫性真菌病害,向日葵黑茎病菌在我国局部地区有发生,茎溃疡病菌未在我国出现,为防患于未然,急需建立一种快速的分子检测技术。

本文描述了向日葵黑茎病菌在大田危害症状和发生时各个时期症状表现,以及观察两种病原菌和向日葵上寄生的其他病原菌的形态特征,其中包括菌落、分生孢子器、分生孢子。

调研人员在宁夏和新疆向日葵病害田间采集的具有明显病害症状的病残体,本文针对两种病原菌致病症状特征对采集回来的病残体进行实验室分离检疫鉴定。

通过形态学以及ITS区域的PCR扩增克隆测序,结果发现,新疆向日葵茎秆编号TXMGX、BXC1、XYHJ为向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii,除此之外,在新疆地区还发现梭孢壳属Thielavia hyalocarpas光黑壳属Preussia sp、向日葵链格孢Alternaria helianth、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、大刀镰孢球黑孢Nigrospora sphaerica,在宁夏地区发现向日葵链格孢Alternaria helianthi与细链格孢Alternaria alternata。

为了建立一种快速检测向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌的分子生物学方法,本研究通过收集不同地区的向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌菌株、向日葵上寄生的其他病害以及购买的标准菌株作为供试材料；以油菜黑茎病菌Leptosphaeria biglobosa的肌动蛋白Actin基因设计的一对引物actF/actR;利用actF/actR对向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌以及向日葵上寄生的其他11种病害菌丝DNA进行Actin-PCR扩增,扩增产物克隆测序经软件比对分析后,依据Actin基因序列差异位点设计2种病原菌的特异引物LLF/LLR和DHF/DHR。

向日葵黑茎病发生分布、分子检测及控制措施研究向日葵黑茎病是近年来在我国新疆伊犁河谷发生的一种国内新病害,2010年被农业部确定为检疫性病害。

该病自发生以来呈不断蔓延之势,对新疆向日葵产业构成严重的威胁。

针对该病及其防治措施的研究成为一个紧迫的任务。

本研究针对该病,从病原菌(Phoma macdonaldii)的生物学特征、致病特性、和分子标记技术等方面开展相关研究,并初步建立病害分子检测技术,筛选出较抗病品种和高效,安全防病用药。

通过真菌rDNA-ITS区段PCR扩增、测序及比对进行对病原菌种的鉴定。

生物学特性及致病性研究表明：该病病原菌为非专性寄生菌,对营养、温度、酸碱适应范围广,坏境适应性强,喜偏酸环境；在自然条件下,自苗期开始整个生育期均可侵染,可侵染向日葵地上各部；人工接种条件下,高湿及有伤接种有利于侵染和发病。

通过特异性引物设计与筛选建立了针对病原菌的分子标记技术；通过特异性引物分子标记技术的灵敏性检测和实测验证初步建立了针对田间病株的分子检测技术。

通过病害分布调查,基本明确了该病在新疆的分布,结果显示伊犁地区和昌吉州部分县市为该病的主要分布区；利用GARP遗传算法模型,结合新疆地理环境和气候特点,采用GIS软件,分析了向日葵茎点霉在新疆的潜在适生情况；采用“多指标综合评估方法”,对该病在新疆向日葵主产区发生的危险程度进行了评估,结果表明：新疆北疆适生性地区较广,主要分布在天山北坡一带,纬度43-50度之间区域。

品种抗性比较结果显示,28个向日葵品种或品系间对黑茎病虽有一定的抗性差异,但普遍比较感病；通过室内和田间的抗性比较,初步筛选出的较抗病品种5个,依次为TO12244、S606、新葵杂7号、Q1026及LD1003。

在室内毒力实验结果表明抑霉净(30%WP)、氟硅唑(10%EW)、戊唑醇(25%SC)及腈菌唑(12.5%EC)对该病原菌具有明显的抑制效果；田间试验证实氟硅唑(10%EW)抑霉净(30%WP)对该病的防效最好。

向日葵黑茎病病菌鉴定及种质资源抗性筛选向日葵黑茎病是一种国内新发现的病害,造成产量和品质严重损失,已成为阻碍向日葵产业发展的关键因素之一。

本研究对部分向日葵主产区采集到的病原菌进行了分离和鉴定。

同时对病原菌生物学特性和菌株的致病力以及向日葵种质资源的抗性进行了分析研究,为进一步开展向日葵抗黑茎病的育种提供依据。

本论文主要研究结论如下:1.从吉林、内蒙古、新疆、河北向日葵黑茎病发生严重的地块采集有典型症状的34个病株进行了病原物分离,通过组织分离法获得18个菌株。

分离和鉴定结果表明:经鉴定引起吉林、内蒙古、新疆、河北地区的18个向日葵菌株的生物学特性与致病性,该菌为麦氏茎点霉(Phoma macdonalddii Boerema)。

2.致病性研究表明:YS04、HJB、ZJK-2,BC202致病力相对较强,症状表现为侵染快、发病早、茎秆黑色病斑症状严重;88-1k、WLH3、ZJK-9致病力相对较弱,症状表现为发病较晚,茎秆黑色病斑症状较轻;ZJK-10、ZJK-8、88-5h、BJ2、88-2h、HJC、JBL4、ZJK-12、ZJK-5、WZ15 和 BC202 致病力弱,侵染慢,发病迟缓,茎秆黑色病斑症状轻。

3.不同向日葵种质资源抗性研究表明:本试验中所筛选的不同向日葵种质资源中132083、132088、131023三个向日葵材料的抗性接近抗病对照品种(JK103),其余的48个供试材料及非抗对照品种LD5009属于易感的向日葵种质资源。

4.通过比较52个供试向日葵种质资源的防御酶活性发现,抗性不同的向口葵种质资源间,其防御酶活性的变化趋势存在差异。

其中供试向日葵材料132083、132088、131023的防御性酶活性接近于抗病对照品种(JK103),其余供试材料的POD、SOD、CAT的相对含量均低于感病对照品种(LD5009),发病病斑症状都比感病对照品种LD5009要大且严重。

因此,这些材料是比感病对照品种(LD5009)更感的材料。

向日葵黑茎病菌分离鉴定及其RFLP分析张祥林;刘彬;王翀;乾义柯;罗明;陈燕【摘要】[ Objective] The pathogen was isolated and identified which has caused sunflower black stem in Xinjiang recently.[ Method] The pathogen was separated and culturated from the sunflower black stem’ s plants which were collected in the fields by the traditional method . The fungus’ morphology characteristics were obsewed, its district was analysed and amplified by PCR. The pathogen’s RFIP was analyzed by 10 kinds of different enzymes. [ Result] The morphological observation showed the pathoSen belongs to Phoma . The homology of the pathogen and Phoma helianthi Taberosi reached 99％ . The results identified that it belongs to Phoma helianthi Taberosi. [ Conclusion]The results indicated that the pathogen of sunflower black stem belongs to Phoma helianthiTaberosi .%[目的]对新疆近期发生的向日葵黑茎病进行病原菌分离鉴定,并对该菌进行RFLP分析.[方法]用常规分离培养法从田间采集的向日葵黑茎病病株获得致病菌,观察该菌的形态学特征;用PCR法对该菌115区进行扩增和测序,并与向日葵茎点霉黑茎病菌进行分子比对,明确二者的同源性;选取10种限制性内切酶对该菌的ITS区PCR产物进行RFLP分析.[结果]该菌的形态学特征为茎点霉属真菌,与向日葵茎点霉黑茎病菌的同源性达到99%以上,说明该致病菌为向日葵茎点霉黑茎病菌Phoma helianthi Taberosi.通过RFLP分析确定了该病菌的酶切位点.[结论]该致病菌的形态学和分子生物学鉴定结果表明,向日葵黑茎病由向日葵茎点霉黑茎病菌引起.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2011(048)002【总页数】6页(P204-209)【关键词】向日葵黑茎病;向日葵茎点霉黑茎病菌;分离;鉴定;RFLP;PCR【作者】张祥林;刘彬;王翀;乾义柯;罗明;陈燕【作者单位】新疆出入境检验检疫局,乌鲁木齐,830063;新疆出入境检验检疫局,乌鲁木齐,830063;新疆农业大学农学院,乌鲁木齐,830052;新疆出入境检验检疫局,乌鲁木齐,830063;新疆出入境检验检疫局,乌鲁木齐,830063;新疆农业大学农学院,乌鲁木齐,830052;新疆出入境检验检疫局,乌鲁木齐,830063;新疆农业大学农学院,乌鲁木齐,830052【正文语种】中文【中图分类】S435.655;S188+.20 引言【研究意义】栽培向日葵Helianthus annuus var.Macrocarpus起源于北美洲,在我国至今约有360 a种植历史,其主要种植地区分布在东北、华北、西北和西南等地,是我国五大油料作物之一[1]。

向日葵黑茎病菌检疫鉴定方法1 范围本文件规定了向日葵黑茎病菌的检疫鉴定方法。

本文件适用于向日葵种子中向日葵黑茎病菌的检疫鉴定以及携带向日葵黑茎病菌的寄主植株等材料的田间检测。

2 规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。

3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。

4 基本信息中文名：向日葵黑茎病菌学名：Leptosphaeria lindquistii Frezzi异名：Phoma macdonaldii BoeremaPhoma oleracea var. helianthi-tuberosi.,英文名：Sunflower Phoma black stem分类地位：真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），座囊菌纲（Dothideomycetes），格孢菌亚纲（Pleosporomycetidae），格孢腔菌目（Pleosporales），小球腔菌科（Leptosphaeriaceae），小球腔菌属（Leptosphaeria）。

该病菌的其它相关资料参见附录A。

5 鉴定原理根据向日葵黑茎病菌的培养性状、病原菌形态特征、分子生物学特征对向日葵黑茎病菌进行检测鉴定。

6 仪器和器具冰箱、解剖镜（最低10×）、生物显微镜（具测量功能）、恒温光照培养箱、高压灭菌锅、天平、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、台式离心机、微量紫外分光光度计、高速冷冻离心机、真空抽干仪、实时荧光PCR仪、微量移液器（0.1 µL～2.5 µL，1 µL～10 µL，10 µL～50 µL，20 µL～200 µL，100 µL～1000 µL）、接种针、镊子、酒精灯、荧光灯、滤纸、培养皿（直径90 mm～100 mm）、手术剪、手术刀、载玻片、盖玻片、研钵。

7 试剂和培养基70%乙醇、次氯酸钠、CTAB抽提液（2% CTAB，1.4M NaCl，20 mM EDTA，100 mM Tris.HCl pH8.0）、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、无菌双蒸水、TE缓冲液（10 mM Tris.HCl，1M EDTA pH8.0)、实时荧光PCR预混液：2×TaqMan Universal PCR Master Mix（推荐使用，亦可自行配制）。

《向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法》编制说明一、目的意义向日葵茎溃疡病菌（Diaporthe helianthi）是我国进境植物检疫性有害生物，是向日葵上最具破坏性的真菌病原，可引起向日葵毁灭性损失。

病菌可侵染向日葵植株的茎、叶片、荚和种子等所有地上器官。

茎杆和叶柄结合处有灰色水浸状灰褐色病斑，病斑可扩散，变成暗灰或黑色；病斑还可包围茎杆，导致茎杆上部干枯，容易折断，茎杆和叶柄的髓部腐烂坏死。

叶片病斑棕色或黑色，可整叶萎蔫、干枯变黑。

葵盘发育不良，不能形成成熟的种子，或干枯败育，病害严重时整个植株死亡。

该病在欧洲及美洲国家危害严重。

病菌于1979年在前南斯拉夫首次报道，早在1975年美国的向日葵上就有发生情况。

1981~1986年匈牙利、罗马尼亚、法国相继报道了该病菌的发生情况，病菌现已遍布法国所有向日葵栽培区。

前苏联于1985年，在乌克兰乌日哥罗德区的向日葵杂交种索耳道尔上首次发现该病害。

后于1994年出现在西班牙和意大利。

1975年美国明尼苏达州因此病减产60%；1979~1982年前南斯拉夫该病大发生，产量损失50%以上；Projetti（1988）报道，由于该病害的为害已造成法国南部的向日葵损失达70%；另据前苏联1988年报道，在一块实验地，几乎所有的向日葵都被D.helianthi为害致死。

1985~1986年间，匈牙利的向日葵也遭受严重侵染。

该病菌近距离传播主要依靠病菌孢子借助雨水飞溅、病残体以及农事操作工具传播，远距离传播主要通过贸易调运的种子和种子中夹带的植物病残体。

近年来我国向日葵种子的进口量急剧增长，新疆、内蒙、宁夏等西北部地区每年大面积种植从欧洲、北美和南美等地进口的向日葵种子， 2010年上半年仅天津口岸进境的进口向日葵种子就达2000多吨，我们面临的局势十分严峻，如何加大力度防范危险性有害生物随葵花种子传入我国是急切和紧迫的任务，为此国家质检总局发布了《关于防范向日葵茎溃疡病菌传入的警示通报》(质检动函（2010）12号）预警通告。

向日葵枯萎病菌的分离鉴定及其生物学特性高婧;张园园;王凯;张键;张贵;赵君【摘要】为明确向日葵枯萎病的病原菌种类,调查来自不同地区2014-2015年田间向日葵枯萎病株(50份),经过柯赫氏法则鉴定,将分离获得的31株分离物鉴定为镰刀属下的7个不同的种,即尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、轮枝镰刀菌(F.verticilloides)、砖红镰刀菌(teritium)、锐顶镰刀菌(F.acuminatum)、芬芳镰刀菌(F.redolens)、木贼镰刀菌(F.equiseti和层出镰刀菌(F.proliferum).以每个种随机选取的菌株为研究对象,对其生物学特性进行了比较研究.结果表明:轮枝镰刀菌BC012的生长速度最快,而砖红镰刀菌BC03生长速度最慢;产孢量以轮枝镰刀菌BC012最多,而木贼镰刀菌NMG1的产孢量最少.在不同的培养温度下,除锐顶镰刀菌TBB212可在5℃低温下生长外,其余菌株的最适生长温度均为25℃～30℃.所有供试的菌株在pH 4 ～ 11的培养条件下均可生长.不同种的镰刀菌株产毒能力的比较结果表明,尖孢镰刀菌BC102的产毒能力最强,粗毒素含量为0.651 mg/mL;砖红镰刀菌BC03的产毒能力最弱,粗毒素含量仅为0.075 6mg/mL.不同种的镰刀菌的致病力测定结果表明,接种21d后,轮枝镰刀BC012、芬芳镰刀菌WLJ1和锐顶镰刀菌TBB212的病情指数分别为65.0、55.0、55.0,症状表现为侵染快、发病早、病叶边缘变黄变褐且叶面上出现斑驳状病斑;木贼镰刀菌NMG1、层出镰刀菌T5、尖孢镰刀菌BC102和砖红镰刀菌BC03病情指数在30.0至40.0;症状表现为发病较晚,病叶少且症状轻.而对照菌株向日葵黄萎病菌株大丽轮枝菌的病情指数仅为25.0.【期刊名称】《中国油料作物学报》【年(卷),期】2016(038)002【总页数】9页(P214-222)【关键词】向日葵枯萎病;镰刀菌;生物学特性;致病力【作者】高婧;张园园;王凯;张键;张贵;赵君【作者单位】内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特,010018;内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特,010018;内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特,010018;内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特,010018;内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特,010018;内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特,010018【正文语种】中文【中图分类】S435.655向日葵枯萎病是由镰刀菌侵染引起的一种土传病害，常与向日葵黄萎病混合发生，对生产造成危害。

进境向日葵有害生物风险分析及向日葵茎溃疡病菌快速检测技术研究本文对进境向日葵有害生物进行了风险分析,并对向日葵茎溃疡病菌的生物学特性和PCR检测方法进行了研究,建立了该病菌常规PCR和实时荧光PCR检测方法。

通过室内毒力的测定,为该菌的检疫处理提供了理论基础。

本文按照FAO的国际植物检疫措施标准第2号——有害生物风险分析准则,对进境向日葵进行了风险分析。

通过风险评估,筛选出检疫性有害生物7个,其中真菌4个,病毒2个,杂草1个,即向日葵白锈病菌、向日葵茎溃疡病菌、向日葵黑茎病菌、向日葵黄萎病菌、向日葵环斑病毒、烟草环斑病毒、向日葵列当,除了向日葵茎溃疡病菌和向日葵黑茎病菌为高等风险外,其余风险均为中等。

通过检疫审批、药剂拌种、入境口岸检疫和隔离试种等管理措施,可以将输入向日葵的风险降至可接受的水平。

依据风险分析结果,选取向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi)进行深入的研究。

为了建立常规的生物学检测方法,对该病菌的培养条件和生态适应性中的营养条件进行研究。

在不同培养条件(包括培养基、碳源、氮源、温度、酸碱度、光照等条件)和营养条件下,对该菌培养7d,观察其生长状况并测量菌落直径大小。

用SPSS12.0软件进行相应的计算处理、统计分析。

该病菌在PDA、CMA培养基上生长较好,在改良的查彼培养基和WA培养基上生长较慢。

该病菌能充分利用酵母膏和硝酸钾,在6℃-34℃温度范围内正常生长,最适生长温度为23℃-26℃。

适宜生长酸碱度为pH4.0-11.0,最适酸碱度为pH5.0-10.0。

在全光照培养条件下有利于菌丝的生长。

用真菌通用引物ITS4/ITS5对向日葵茎溃疡病菌进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆、酶切分析和测序,并采用4种限制性内切酶对ITS区扩增产物进行酶切分析,为该菌的鉴定提供了一种方法。

用DNAMAN软件分别设计出了检测该病菌的特异性引物PHDF1/PHDF2、PHDF3/PHDF4和TaqMan探针PHDF5,首次在国内建立了该病菌普通PCR和实时荧光PCR方法,通过体系优化和检测结果显示,这两对引物均可将向日葵茎溃疡病菌与其他拟茎点霉属的真菌区分开来。