nf-kb入核免疫荧光检测实验记录

非放射性凝胶迁移试剂盒（EMSA）操作手册 本说明书适用于产品号为SIDET001, SIDET003与SIDET004的产品目录号 产品名称 包装SIDET001非放射性 NF-KB EMSA36 次结合反应SIDET003非放射性 STAT3 EMSA36 次结合反应SIDET004非放射性 STAT5 EMSA36 次结合反应VER. 3.112005年2月目 录1. 简介 (3)2. 试剂盒包装清单 (3)3. 自备实验材料与仪器 (4)4. DNA/蛋白质结合反应 (4)5. 聚丙稀酰胺凝胶电泳 (5)6. 电转移 (6)7. DNA的交联固定 (6)8. 化学发光反应 (6)9. 化学发光图像显示 (7)10．常见问题 (8)11. 参考文献 (8)12．注意事项 (9)2005© Viagene，All rights reserved.1．简介EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。

这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。

当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。

Viagene公司的非放射性EMSA成套试剂盒是结合高灵敏度的化学致发光技术建立起来的实验系统。

与市场上的EMSA产品比较，Viagene公司的EMSA试剂盒操作更简单迅速，并可得到更好的实验效果；与同位素放射法相比Viagene公司的非放射性EMSA试剂盒解决了探针不稳定、同位素辐射等问题，并具有高灵敏度、快速获得结果、避免材料浪费等优点。

目前Viagene公司提供三套非放射性EMSA试剂盒用来检测活化的NF-KB(核转录因子-KB，Cat#; SIDET001)、STAT3(信号转导和转录激活因子3，Cat#; SIDET003)和STAT5(信号转导和转录激活因子5，Cat#; SIDET004)。

第42卷第3期 2021年3月激光杂志L A S E R J O U R N A LVol . 42,No . 3 March , 2021•医用光学•A L A -P D T 通过N F -kB 通路调节巨噬细胞极化状态张文涛，杨伟江，罗杰夫，岑蕊言，杨涛，陈劲奕，谭杨，雷霞陆军军医大学大坪医院，重庆400042摘要：目的：探讨A L A -P D T 对巨噬细胞极化的影响，并探讨相关机制。

方法：采用免疫荧光、P C R 、W B 等试验检测巨噬细胞极化特征蛋白C D 86、CD 206、iN O S 、A R G -l 的表达水平变化，N F -k B 激活-核转运检测试剂、W B 试验检测N F -k B 通路激活情况，W B 试验检测抑制N F -k B 通路后C D 86、iN O S 蛋白表达水平。

结果：免疫荧光、PC R 、W B 实验结果显示，P D T 处理后，巨噬细胞M l 特征蛋白C D 86、iN O S 表达水平增高，M 2特征蛋白表 达水平下降（P<〇. 05)。

N F -k B 激活-核转运检测、W B 实验结果表明P D T 处理后，N F -k B 通路被激活。

给予N F -k B 通路抑制剂处理，P D T 处理后巨噬细胞M l 特征蛋白C D 86、iN O S 表达水平增高现象被抑制。

结论:ALA -P D T 通过激活N F -k B 通路促进巨噬细胞向M l 极化。

关键词：光动力疗法（PDT );巨噬细胞；极化；NF -k B 通路中图分类号：R 454. 2 文献标识码：A doi ：10. 14016/j . cnki . jgzz . 2021. 03. 197AIA-PDT regulates macrophage polarization through the N F-K B pathwayZHANG W entao , YANG W eijiang , LUO Jiefu , CEN Ruiyan , YANG T ao ,CHEN Jinyi,TA N Y ang , LEI XiaD aping H o sp ita l , A rm y M edical U n iversity , C hongqing 400042 , C hinaAbstract ：Objective ： To investigate the effect of ALA-PDT on macrophage polarization and its related mecha ­nism . Methods ： Immunofluorescence , PCR , W B and other tests were used to detect the expression levels of CD 86, CD 206, iNOS and ARG -1 , NF-kB activation-nuclear transfer detection reagent and WB test were used to detect the activation of NF-kB pathway and the expression levels of CD 86 and iNOS after the inhibition of NF-kB pathway by W B test . Results ： Immunofluorescence , PCR and WB showed that the expression levels of CD 86 and iNOS of M l - characteristic protein in macrophages increased , while the expression levels of M 2-characteristic protein decreased af ­ter the treatment of PDT ( P <0. 05). The NF-kB activation-nuclear transfer test results showed that the NF-kB path ­way was activated after the treatment of PDT . After treatment with the NF-kB pathway inhibitor , the expression levels of CD 86 and iNOS of macrophage Ml characteristic proteins were inhibited after PDT treatment . Conclusion ： ALA - PDT can promote macrophage polarization to Ml by activating NF-kB pathway .Key words：photodynamic therapy (PDT )； macrophages ； polarization ； NF-KB pathway性物质原卟啉ix ( Protoporphyrin IX ，PPIX )，经一定波 长光照射后在组织内产生单态氧、氧自由基等氧活性物质，杀伤病变细胞，达到治疗目的[1]。

细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Immun〇l)2021, 37(5) 421.论著.文章编号：1007-8738(2021 )05>0421^06丙戊酸钠通过激活核因子k B(NF-k B)通路引起大鼠HAPI小胶质细胞炎症反应賡爱玲，王岩，兰俊英，杨戎王莎莉*(重庆医科大学基础医学院生理学教研室，重庆400016)[摘要]目的研究丙戊酸钠（VPA)诱发HAPI小胶质细胞炎症反应的可能机制。

方法体外培养大鼠HAPI小胶质细胞，分别给予(0、0.25、0.5、1、2.5、5)mm〇l/L VPA处理24 h。

显微镜观察各组细胞生长及形态变化，CCK-8法检测细胞存活率，ELISA检测各组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子a (TNF-ot)的含量。

以2.5 mmol/L VPA作为最适浓度，Western blot法检测核 因子k B抑制物（I k B)激酶a/p( IK K a/p)、磷酸化的I k B激酶(PIK K a/p)、肿瘤坏死因子a (TNF-a〇、白细胞介素1 p(IL-1 p)的蛋白表达，激光共聚焦显微镜技术观察NF-k B p65蛋白核转位情况。

结果随着VPA浓度增高，HAPI细胞逐渐伸出丝状伪 足，并最终激活形成阿米巴样形态，且HAPI细胞的存活率不断降低；当VPA的浓度增高至1mmol/L后，小胶质HAPI细胞分 泌的TNF-a明显高于正常对照组。

2. 5 mmol/L VPA处理的HAPI细胞NF-k B通路相关蛋白IKKa/p、pIKKa/p、TNF-a、IL-1(3表达明显增高，同时伴随HAPI细胞中NF-K B p65蛋白表达由胞质中高表达转为主要在细胞核内表达。

结论高浓度VPA通 过激活HAPI小胶质细胞NF-K B通路，引起炎症反应。

[关键词]丙戊酸钠（VPA); HAPI小胶质细胞；炎症；核因子K B(NF-K B)[中图分类号]R971+.6,R364.5,R392.12 [文献标志码]ASodium valproate induces HAPI microglia inflammatory response in rats by activating NF-k B pathwayLIAO Ailing, W A N G Yan, L A N Junying, Y A N G Rong*, W A N G Shali*D e p a rtm e n t o f P h y s io lo g y, S c h o o l o f B a sic M e d ic a l S c ie n c e s, C h o n g q in g M e d ic a l U n iv e rs ity, C h o n g q in g400016, C h in a* C o rre sp o n d in g a u th o r s, E-m a i l：63557408@q q.c o m；1364262572@q q.c o m[A b s tra c t] Objective To investigate the possible mechanism of scxJium valproate (VPA) inducing HAPI microglia inflammatory response. Methods HAPI microglia were cultured in vitro and treated with VPA of 0,0.25, 0.5, 1, 2.5, 5 mmol/L for 24 hours. The cell growth and morphological changes in each group were observed under inverted microscope, the cell viability determined by the CCK-8 assay, and the level of tumor necrosis factor a (TN F-a) in the cell culture supernatant of each group measured by ELISA. The protein expressions of I k B kinase a/p(IK K a/p), phosphorylated I k B kinase (p IK K a/p), TNF-a, and interleukin-1 p (IL-ip) were detected by Western blot with 2.5 mmol/L of VPA as the optimal concentration. The nuclear translocation of NF-k B p65 was observed by confocal laser scanning microscopy. Results With the increase of VPA concentration, HAPI cells gradually extended filopodia and finally became activated to form amoeboid microglia, and the viability of HAPI cells decreased continuously；when the concentration of VPA increased to 1mmol/L, the TNF-a secreted by HAPI microglia was significantly higher than that by cells in the normal control group. The expression levels of NF-k B pathway related proteins IKK〇c/(3, pIKKa/p, TNF-a, and IL-ip in HAPI cells treated with 2.5 mmol/L of VPA were significantly increased, and the NF-k B p65 in those HAPI cells was highly expressed in the nucleus rather than in the cytoplasm. Conclusion High concentration of VPA induces HAPI microglia inflammatory response by activating NF-k B pathway.[Key words] sodium valproate (VPA) ；HAPI microglia；inflammation；nuclear factor k B (NF-k B)丙戊酸钠（sodium valproate, V P A)是临床广泛应 伤和胎儿发育异常[~，包括胚胎神经管缺陷，兔唇，用的抗癫痫药物，对神经系统具有保护作用+3]，但 先天性心脏病、自闭症等神经发育障碍疾病[5_7]。

免疫荧光染色实验记录模板
1. 实验日期和实验者信息，记录实验进行的日期和实验人员的姓名或编号，以便追溯实验操作和结果的责任人。

2. 样本信息，包括样本来源、处理方法、处理时间和处理条件等信息。

确保记录样本的处理过程，以便在实验结果出现问题时进行排查。

3. 抗体信息，记录使用的抗体信息，包括抗体的来源、批号、稀释倍数、存储条件等。

这些信息对实验结果的准确性和可重复性非常重要。

4. 染色条件，记录染色的条件，包括染色液的配制方法、染色时间、温度等。

这些条件对实验结果的准确性和可重复性有重要影响。

5. 显微镜观察，记录观察到的样本荧光信号情况，包括荧光强度、分布情况等。

这些观察结果是实验结果的直接呈现，需要详细记录。

6. 图像记录，如果有条件，最好拍摄实验样本的荧光图像，并记录图像的拍摄条件和处理方法。

图像记录可以作为实验结果的直观呈现。

7. 结果分析，对实验结果进行简要分析和总结，包括样本的阳性率、荧光强度的定量分析等。

这些分析结果可以帮助理解实验结果的意义和可靠性。

以上是免疫荧光染色实验记录模板的基本内容，通过完整记录实验过程和结果，可以提高实验的可重复性和结果的可靠性，为科研工作提供有力支持。

免疫荧光实验报告免疫荧光实验报告免疫荧光实验是一种常用的生物学实验方法，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。

本次实验旨在研究细胞膜上的蛋白质表达情况，并通过荧光显微镜观察和分析实验结果。

实验材料和方法本实验使用的材料包括细胞培养物、PBS缓冲液、甲醛、牛血清白蛋白（BSA）、荧光标记的抗体（一抗和二抗）、荧光显微镜等。

实验方法如下：1. 细胞培养：将细胞培养物均匀地分散在培养皿中，添加适量的培养基，并将其放入恒温培养箱中培养。

2. 固定细胞：在培养皿中加入PBS缓冲液，用甲醛进行固定处理，使细胞膜上的蛋白质保持原有的结构。

3. 蛋白质封闭：将BSA溶液滴加在固定后的细胞上，使其与细胞膜结合，防止非特异性结合。

4. 一抗处理：将荧光标记的一抗滴加在细胞上，使其与目标抗原结合。

一抗可以识别特定的蛋白质或抗原。

5. 二抗处理：将荧光标记的二抗滴加在细胞上，使其与一抗结合。

二抗通常与荧光染料结合，用于增强荧光信号。

6. 荧光显微镜观察：将处理后的细胞放置在荧光显微镜下观察，通过荧光显微镜的特定波长激发荧光标记的抗体，并观察荧光信号的分布和强度。

实验结果和分析在荧光显微镜下观察，我们可以清晰地看到细胞膜上的荧光信号。

这些信号代表了目标蛋白质的表达情况和分布。

通过对不同细胞或组织的荧光信号进行定量和比较分析，我们可以得出以下结论：1. 蛋白质的表达量：荧光信号的强度反映了蛋白质在细胞膜上的表达量。

强荧光信号表示高表达，而弱荧光信号则表示低表达。

通过与对照组进行比较，我们可以判断目标蛋白质的表达水平。

2. 蛋白质的分布：荧光信号的分布情况可以告诉我们蛋白质在细胞膜上的位置。

如果荧光信号集中在细胞膜的特定区域，说明该蛋白质在该区域有高表达。

而分散的荧光信号则表示蛋白质在整个细胞膜上均匀分布。

3. 蛋白质的定位：通过与其他标记物的共定位实验，我们可以确定蛋白质在细胞膜上的具体位置。

例如，我们可以使用荧光标记的抗体与细胞核染色剂共同处理，观察荧光信号与细胞核的重叠情况，从而确定蛋白质是否定位在细胞核。

大鼠核转录因子(NF-kB )酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：96T80 ng/L -2000 ng/L使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中核转录因子(NF-kB )含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠核转录因子(NF-kB )水平。

用纯化的大鼠核转录因子(NF-kB )抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入核转录因子(NF-kB )，再与HRP标记的核转录因子(NF-kB )抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的核转录因子(NF-kB )呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠核转录因子(NF-kB )浓度。

试剂盒组成标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

NF_KB的激活与检测方法生命活动中的一系列重要过程如细胞增殖、分化等是通过基因表达来实现的，这种基因表达控制首先通过特定转录因子在转录水平上进行。

核转录因子(nuclear transcription factor)是一类蛋白质，它们具有和某些基因上启动子(promotor)区的固定核苷酸序列结合，而启动基因转录的功能。

核转录因子kappa B(NF-κB)是其中重要的一组蛋白质，也是一类重要的转录激活因子，广泛存在于各种真核细胞中【1】。

1986年，Sen 等【2】首次从鼠B淋巴细胞核提取物中，发现一种能与免疫球蛋白K轻链基因增强子KB序列(GGGACTTTCC)特异结合，调节其基因表达的核蛋白因子，?称之为NF-κB。

它们可以调节许多与免疫功能和炎症有关的基因，在机体生理和病理条件下，发挥重要的功能。

现已表明NF-κB的功能涉及到免疫反应、胸腺发育、胚胎发生、炎症和急性反应、细胞繁殖、细胞凋亡、病毒感染等多种病理过程。

1. NF-KB的概述1.1 NF-KB/Rel蛋白家族及结构在哺乳动物细胞中共有五种NF-κB家族成员【3】，它们是原癌基因C—Rel、NF—κB1(p50／p105)、NF—κB2(p52／p100)、Re1A(p65)、RelB。

这些蛋白都有一个大约由300个氨基酸组成的氨基末端，称为Rel同源区(Rel homogeneous domain，RHD)或NRD(NF—κB／Rel／dorsa1)。

其RHD含DNA结合区，二聚体化区和核定位序列，分别具有与DNA -κB序列结合、与同源或异源亚基二聚体化以及与NF-κB抑制蛋白（IKB）家族成员相互作用并携带核定位信号（NLS），参与活化的NF-κB由细胞质向细胞核的迅速移动等功能。

根据结构、功能和合成方式的不同，Rel蛋白分为两类。

?一类为P50(?NF-?KB1）和P52(?NF-?KB2），?分别由含有C-末端锚蛋白重复序列（ahkrin ??repeat motif）的前体蛋白p105和p100通过ATP 依赖蛋白水解过程裂解而形成。

nf-kb入核免疫荧光检测实验记录NF-κB是一种转录因子，在细胞内起着重要的调控作用。

为了了解NF-κB的活性和定位，科学家们通常利用免疫荧光检测来进行实验。

下面是一份关于NF-κB入核免疫荧光检测实验的记录，其中不得出现链接。

实验目的：本实验旨在检测细胞中NF-κB的活性和定位，以了解其在细胞核内的转录调控作用。

实验材料和设备：1. 细胞系（例如人类胚胎肾细胞293细胞）。

2. 细胞培养基（例如DMEM）和胚胎牛血清（FBS）。

3. 4% paraformaldehyde（PFA）溶液。

4. PBS缓冲液。

5. 细胞裂解液（例如RIPA缓冲液）。

6. 3% BSA。

7. NF-κB抗体（例如兔抗人NF-κB抗体）。

8. Cy3（荧光标记的次抗体）。

9. 荧光显微镜。

实验步骤：1. 培养细胞系并将其接种到培养皿中。

保存细胞在37°C、5% CO2的环境中培养到合适的浓度。

2. 将培养皿中的培养基抽去，并用PBS缓冲液冲洗细胞3次，每次5分钟。

3. 用4% PFA溶液固定细胞，孵育15分钟。

4. 用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟。

5. 用3% BSA溶液进行细胞膜的封闭处理，孵育1小时。

6. 使用适当稀释的NF-κB抗体溶液与细胞接触，孵育1小时。

7. 用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟。

8. 使用Cy3标记的次抗体与细胞接触，孵育30分钟。

9. 用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟。

10. 在显微镜下观察细胞，并使用合适的荧光标记通道检测Cy3的荧光信号。

实验结果：通过显微镜观察，我们观察到了细胞中NF-κB的荧光信号。

我们发现在核内存在明亮的红色荧光信号，表明NF-κB在核内特定结构中定位。

与此相比，胞质中的荧光信号相对较弱。

讨论：NF-κB作为一个转录因子，在细胞核内参与转录调控。

我们的实验结果表明，NF-κB在细胞核内存在集中的定位，并且与特定的细胞结构相互作用。

这一发现表明NF-κB可能通过与其他转录因子或调控元件结合来调控特定基因的转录。

喉癌组织中核转录因子NF?kB的定量检测【摘要】探讨核转录因子(nuclear transcription factor kappa B, NF?kB)的定量检测在喉癌组织中的意义。

方法：采用蛋白质印迹杂交法（Western blot法）和凝胶电泳迁移率（EMSA）法对20例喉癌组织和10例癌旁正常组织中NF?kB的蛋白含量以及NF?kB DNA结合活性进行定量检测，并进行分析比较。

结果：喉癌组织中NF?kB的蛋白含量以及NF?kB DNA结合活性均明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）。

结论：NF?kB在喉癌的发生发展过程中可能起一定的作用，并为喉癌的治疗能提供一个新靶点。

【关键词】喉肿瘤核转录因子蛋白质印迹杂交凝胶电泳迁移率A A quantitative analysis of NF?kB in laryngeal carcinoma［ABSTRACT］ Objective: To explore the significance of the quantitative analysis of NF?kB in laryngeal carcinoma tissues. Methods: The quantitative analysis of the protein content and the DNA binding activity of NF?kB was examined by the Western blot method and electrophoretic mobility shift assay (EMSA) method in 20 cases of laryngeal carcinoma tissues and 10 cases of normal pericarcinoma tissues. Results: The protein content and the DNA binding activity of NF?kB in laryngeal carcinoma tissues were higher than those in pericarcinoma normal tissues（P<0.05）. Conclusion: The NF?kB might play an important role in the occurrence and development of laryngeal carcinoma and offers a new target of laryngeal carcinoma treatment.［KEY WORDS］ Laryngeal neoplasms; Nuclear transcription factor kappa B; Western blot; Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)核转录因子（NF?kB）广泛存在于真核细胞中，通过调控众多下游基因的转录来参与机体的免疫应答、炎症反应、细胞凋亡和肿瘤形成过程。

免疫荧光法检测APPSWE转基因小鼠海马内NF【摘要】目的：了解阿尔茨海默病转基因小鼠海马内nf-κb的激活情况。

方法：选用12月龄的阿尔茨海默病转基因阳性小鼠为模型，同窝生野生型小鼠为对照，免疫荧光法检测其海马内nf-κb 的表达。

结果：与对照鼠相比，ad转基因模型小鼠海马细胞内nf-κb的表达增多。

结论： nf-κb在阿尔茨海默病的发病中可能起重要作用。

【关键词】阿尔茨海默病；转基因小鼠；海马；免疫荧光阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，ad）是一种进行性中枢神经系统退行性疾病，其主要临床表现为记忆减退、认知障碍等，发病机制尚不完全明确[1]。

核因子κb（nf-κb）是一种具有多向转录调节作用的蛋白质，与神经细胞的生长、发育、塑型有关，在多种急、慢性神经退行性变中发挥作用，本文拟通过研究阿尔茨海默病小鼠模型海马中nf-κb水平的变化，了解其在阿尔茨海默病发生发展中的作用。

1 材料、仪器1.1实验材料1.1.1主要试剂兔抗鼠nf-κb多克隆抗体（santa cruza公司），tap酶（promega 公司），蛋白酶k、dntp（大连宝生物工程有限公司），tris（上海化学试剂总厂有机化工厂），pcr引物（北京百泰克生物技术有限公司合成）。

1.2主要仪器荧光显微镜（bx61， olympus），扩增仪gene amp 2400，ta-2r 台式冷冻离心机（上海市离心机械研究所），dyy-ⅲ-5型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂），wd-9403f紫外仪（北京市六一仪器厂）。

1.3实验动物动物、动物鉴定及分组：appswe转基因模型鼠（tg2576，美国taconic company），购于南京大学模式动物研究所，随机选取同窝生的appswe阳性小鼠和阴性鼠进行实验。

2 实验方法2.1 dna提取小鼠出生后10d，剪尾巴0.5cm，置1.5ml ep管，加缓冲液（500?l 消化液+5?l 蛋白酶k）500?l，55℃的水浴中消化过夜；消化好的组织摇匀，每管加入500?l酚/氯仿（体积比1：1），混匀、离心（12000rpm，10min）；转移上清液400?l至新的1.5ml ep管内，加800?l无水乙醇混匀，离心（12000rpm，5min）后弃去上清，加入800?l70%乙醇，离心（12000rpm，5min），弃去上清后晾干；加入200?lte，放入37℃水浴1小时助溶后低温保存。

nf-kb入核免疫荧光检测实验记录
nf-kb入核免疫荧光检测实验记录
日期: [日期]
实验目的: 检测nf-kb的入核情况
实验步骤:
1. 培养细胞: 将待测细胞以适当密度接种到培养皿中，并放入37°C恒温培养箱中培养24小时，使细胞达到对照组和实验组相同的生长状态。

2. 处理细胞: 根据实验组和对照组的要求，对细胞进行相应的处理，如添加刺激因子、药物等。

3. 固定细胞: 用4% paraformaldehyde固定细胞，室温静置15分钟。

4. 渗透化处理: 用0.2% Triton X-100在室温下处理细胞，室温静置10分钟。

5. 封闭液处理: 用5% bovine serum albumin (BSA)封闭液处理细胞，室温静置1小时。

6. 一抗处理: 将nf-kb的一抗与PBS稀释后加入培养皿中，室温静置2小时。

7. 清洗液处理: 用PBS清洗液清洗细胞，每次清洗5分钟，共洗涤三次。

8. 二抗处理: 将荧光标记的二抗（如荧光素或辣根过氧化物酶标记）与PBS稀释后加入培养皿中，室温静置1小时。

9. 清洗液处理: 同步6步骤。

10. 核染色: 可根据需要在此步完成核染色，如使用DAPI染色
核酸。

11. 显微镜观察: 将培养皿放置在荧光显微镜下观察和记录nf-
kb的分布情况。

实验结果: 记录观察到的nf-kb入核情况，并与对照组进行比较。

实验结论: 对实验组和对照组的nf-kb入核情况进行分析比较，并得出结论。

备注: 实验过程中的特殊步骤和注意事项等。

人核因子κB(NF-κB)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用产品编号：CSB-E12107h检测范围：0.32ng/mL -20ng/mL最低检测限：0.08ng/mL特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的NF-κB，且与其他相关蛋白无交叉反应。

有效期：6个月预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中NF-κB 含量。

说明1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。

2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗NF-κB抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗NF-κB抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB 显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的NF-κB呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制1.酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。

2.标准品（Standard）：2瓶(冻干品)。

3.样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。

4.生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。

5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。

6.生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

NF-κB激活－核转运检测试剂盒产品简介：NF-κB激活－核转运检测试剂盒(NF-κB Activation，Nuclear Translocation Assay Kit)是通过免疫荧光染色检测NF-κB的主要亚基p65是否转运到细胞核内从而确认NF-κB是否被激活的检测试剂盒。

本试剂盒中的NF-κB p65抗体可以识别人、小鼠或大鼠的NF-κB p65亚基，因此本试剂盒可以检测人、小鼠或大鼠细胞或组织中的NF-κB核转运激活。

本试剂盒提供了固定液、洗涤液、封闭液、一抗、荧光标记二抗、细胞核荧光染色液、封片液，使用时不必再配制其它任何溶液。

提供了细胞核荧光染色液，可以把细胞核染成蓝色荧光，这样可以清楚地判断NF-κB是否被转运到细胞核内而被激活。

NF-κB是一种常见的转录因子，可以被炎症因子、生长因子或趋化因子等激活。

常见的炎症因子(包括Interleukin-1 和TNF-α等)都可以激活NF-κB。

NF-κB由两类亚基形成同源或异源二聚体。

一类亚基包括p65(也称RelA)、RelB和C-Rel；另一类亚基包括p50和p52。

最常见的NF-κB亚基组成形式为p65/p50或p65/p65。

NF-κB未被激活时和IκB-α形成一个复合物，分布在细胞浆中。

在炎症因子、生长因子或趋化因子等可以激活NF-κB的刺激存在的情况下，IκB-α会在Ser32和Ser36被磷酸化，随后被泛素-蛋白酶体途径降解。

NF-κB和IκB-α解聚后，其核定位序列被暴露，从而被转运到细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录。

通过免疫染色检测NF-κB的主要亚基p65是否被转移到细胞核内，就可以判断NF-κB是否被激活。

本NF-κB激活－核转运检测试剂盒仅染色p65，不染色RelB、C-Rel、p50和p52。

使用本试剂盒染色后NF-κB呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。

如果检测组织切片或6孔板内的细胞样品，至少可以检测50个样品，如果检测96孔板内的样品，至少可以检测250-500个样品。

MT-3通过激活NF-κB信号通路抑制食管癌病理进展王海军;陆欣;张彦芬;刘聚良;韩永强【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2016(026)022【摘要】目的：食管癌的发生与多种基因突变相关，基因的表达异常产生肿瘤，本文集中探讨食管癌的发生发展机制。

方法选取河北医科大学附属邢台人民医院2009年7月-2011年2月肿瘤科食管癌患者92例。

选取其肿瘤组织及其癌旁组织样本，检测金属硫蛋白3（MT-3）在食管癌组织和其癌旁组织中的表达，在食管癌细胞系中构建过表达MT-3和低表达MT-3的细胞系，检测这些MT-3表达不同时，NF-κB信号通路在其中是否处于激活状态。

采用Western blot检测P65、pP65蛋白的表达，免疫荧光检测pP65是否在MT-3过表达时有入核表达。

结果定量聚合酶链反应（qPCR）结果显示食管癌肿瘤组织中MT-3的表达高于癌旁组织（=0.001）。

通过qPCR检测构建的高表达和低表达MT-3的食管癌细胞系均成功构建，进而检测P65、pP65，显示在过表达MT-3时，pP65蛋白表达增多，低表达MT-3时pP65蛋白表达减少，P65则显现出相反的结果，且表达均有统计学意义，所以认为MT-3高表达时NF-κB信号激活。

免疫荧光检测高表达MT-3的食管癌细胞时，细胞核入核明显增多，进一步说明MT-3激活了NF-κB信号通路。

结论 MT-3在食管癌中通过激活NF-κB信号通路进而抑制食管癌的病理进程。

%Objective To research the development mechanism of esophageal cancer. Methods Ninety-two cases of esophageal cancer patients treatedin Xingtai Pepole's Hospital of Hebei Medical University from July 2009 to February 2011 were selected for the study. MT-3 expression was detectedin esophageal cancer tissues and the peri-cancerous tissues. MT-3 overexpression and low-expression cell lines were constructed. The activation state of NF-κB signaling pathway was checked at different le vels of MT-3 expression. Then the expressions of P65 and pP65 were tested by Western blot. Immunofluorescence was used to further test whether pP65 was expressed in the nuclei when MT-3 was over-expressed. Results The expression of MT-3 in the tumor tissues was higher than that in the adjacent tissues ( = 0.001). A high MT-3 expression esophageal cancer cell line and a low MT-3 expression cell line were successfully constructed.pP65 protein expression was enhanced when MT-3 was over-expressed, but decreased at low MT-3 expression; in contrast, P65 showed the opposite results with significant differences, whichsuggested NF-κB signal was activated when MT-3 was over expressed. Immunofluorescence revealed that in MT-3 overexpression cells, more pP65 was expressed in the nuclei, which further supported that MT-3 activated NF-κB signaling pathway. Conclusions MT-3 suppresses the pathological process of esophageal cancer through activation of NF-κB signals.【总页数】5页(P23-27)【作者】王海军;陆欣;张彦芬;刘聚良;韩永强【作者单位】河北医科大学附属邢台人民医院胸外科，河北邢台 054001;河北医科大学附属邢台人民医院血液科，河北邢台 054001;河北医科大学附属邢台人民医院胸外科，河北邢台 054001;河北医科大学附属邢台人民医院胸外科，河北邢台 054001;河北医科大学附属邢台人民医院胸外科，河北邢台 054001【正文语种】中文【中图分类】R735.1【相关文献】1.IL-18通过调控PI3K/AKT与NF-κb信号通路激活肿瘤免疫抑制结肠癌的机制[J], 刘立; 盖金娜; 尹作文; 陈琴华2.钙激活的氯离子通道A4通过抑制JAK激酶2/信号转导及转录激活蛋白3信号通路对食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响 [J], 蒋可心;李宁;张旭3.NF-κB信号通路激活剂LPS/抑制剂SN50对鸭肠炎病毒增殖影响的研究 [J], 张飘;程振涛;文明;罗引幸;李涛;杨霞;曾茂芹;刘妍罕;张扬子;杨颖;温贵兰4.新鱼腥草素钠通过抑制STAT3/NF-κB信号通路的激活改善小鼠炎症性肠病 [J], 邓学杰;王振;胡容;卢静;程征宇;杨少奇5.新鱼腥草素钠通过抑制STAT3/NF-κB信号通路的激活改善小鼠炎症性肠病 [J], 邓学杰;王振;胡容;卢静;程征宇;杨少奇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

nf-kb入核免疫荧光检测实验记录NF-κB (核因子 kappa B) 是一种转录因子，广泛参与细胞核内的转录调控。

为了研究NF-κB的活性及其在细胞中的调控机制，科研人员通常使用免疫荧光检测技术。

下面是一份关于NF-κB入核免疫荧光检测实验的记录及相关参考内容。

实验目的：了解NF-κB的活性及其在细胞中的定位和调控机制。

实验步骤：1. 细胞培养：在培养皿中培养细胞系（如人类肺癌细胞系A549），培养条件为37°C、5% CO2的细胞培养箱中，使用适当的培养基（如DMEM）和10% FBS。

2. 细胞刺激：将细胞培养至80%的浓度后，加入适当的刺激剂，如TNF-α或IL-1β，在特定的时间点进行刺激（如1小时，6小时或24小时）。

3. 固定细胞：使用4% paraformaldehyde固定细胞，通常在室温下固定15-20分钟。

4. 渗透化：将PBS含0.1% Triton X-100加入固定的细胞中，室温下渗透化10分钟。

5. 阻断非特异性结合：使用5%牛血清白蛋白（BSA）或3%牛血清和0.3% Triton X-100的PBS溶液阻断非特异性结合，室温下孵育1小时。

6. 免疫染色：使用特异性抗体（如抗-NF-κB）孵育细胞，通常在4°C下孵育过夜。

7. 清洗：使用PBS洗涤细胞，通常洗涤三次，每次约5分钟。

8. 二抗染色：使用荧光标记的二级抗体（如荧光标记的抗兔IgG）孵育细胞，通常在室温下孵育1小时。

9. 清洗：使用PBS洗涤细胞，通常洗涤三次，每次约5分钟。

10. 染色：使用荧光染料，如DAPI，将细胞核染色，通常在室温下孵育10分钟。

11. 显微镜观察：将试片置于显微镜波长合适的镜头下观察，并拍摄荧光图像。

结果与讨论：本实验通过NF-κB的免疫荧光检测技术检测到了细胞中的NF-κB的定位和活性。

NF-κB主要存在于细胞浆中，并在细胞外刺激后转移到细胞核中，因此在未受刺激时，细胞核中应该没有或很少有NF-κB的荧光信号。