实验2研究生 PCR产物鉴定及PCR原理,应用81页PPT

PCR 的 基 本 原 理 和 应 用
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.

11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件 少的靶序列。
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操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
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B.阴性对照
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C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
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精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel

PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1第一轮2 扩增3
4
5
时间（min）
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退 火 PCR的基本原理
3扩增 在PCR仪上设置PCR反应参数（具体数据根
据引物和扩增片段的大小而定）：94℃下加热4分钟左右 ；依次94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟 ，循环32次左右；72℃下保温7分钟，使反应产物扩增充 分
4PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增，
其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能 得出正确的结论。ＰＣＲ产物的分析，可依据研究对象和 目的不同而采用不同的分析方法
PCR过程 PCR的特点
第4轮扩增
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PCR的特点
PCR 的特点
• 灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
1. 简便、快速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
2. 对标本的纯度要求低
1. 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
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1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
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锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
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Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
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锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。

引物
根据需要扩增的序列长度和特异性要 求，确定引物的浓度和种类。
PCR扩增及产物分析
扩增
在PCR仪中进行扩增反应，设置适当的温度和循环次数，使DNA片 段得以扩增。
电泳分析
将扩增产物进行电泳分离，通过染色或荧光标记等技术对产物进行 分析和检测。
结果判断
根据电泳结果判断PCR扩增是否成功，并对产物进行定性或定量分析。
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引物合成
将设计好的引物交由专业的引物合成公司进行合 成，得到可用于PCR反应的引物。
反应体系的组成
DNA聚合酶
选择高活性、高保真度的DNA聚合 酶，确保PCR扩增的准确性和特异性。
dNTPs
提供PCR所需的四种脱氧核苷酸，即 dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
缓冲液
提供适宜的酸碱度和离子浓度，维持 DNA聚合酶的活性。
基因突变和突变的检测
基因突变检测
PCR技术可以用于检测基因突变，通过设计特定的引物，可以扩增特定的DNA片段，通过比较正常和异常序列的 扩增产物，可以检测出基因突变的位置和类型。
突变筛选
利用PCR技术可以对大量样本进行突变筛选，通过设计针对特定突变的引物，可以对大量样本进行高通量的突变 检测，有助于疾病的早期发现和治疗。
快速高效
PCR技术能够在短时间内完成DNA的大规模扩增，大大提高了检测效 率。
操作简便
PCR技术流程相对简单，易于操作，使得它在实验室中得到了广泛应 用。
缺点
成本较高
PCR技术所需的仪器、试剂等成本较高， 对于一些经费有限的实验室来说可能是
一个负担。
对样品质量要求高
PCR技术的灵敏度使得其对样品质量 要求较高，样品中微小的杂质或污染

加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
*
cDNA序列的克隆
.
*
（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
.
*
EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
.
*
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
.
*

分子克隆（目的基因的获取和鉴定） 基因片段
质粒DNA
重组DNA
EcoR I 5’
5’
Bam H I
PCR(5’端引入限制酶识别位点) EcoR I
Bam H I
PCR技术应用于科学研究
围绕二硫键构建不同结构的K5缺失突变体（PCR－缺失突变）
Yang X（杨霞）, et al. J Cell Mol Med (IF:5.2), 2010.
琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%胶
3mm、凝固后拔梳）
倒缓冲液，加样（取基因组DNA样品液 8μl+2μl上样缓冲液（5×），混匀, 上样 ）
其余DNA样品交 给老师保存，以 后实验用。
电泳（恒压100V 1小时）
检测（紫外检测）
有关PCR反应
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 Taq DNA聚合酶 Mg2+ 模板DNA 各200μmol/L 各10～100pmol 2.5u 1.5mmol/L 0.1～2μg
C：正常人DMD基因外显子 的一般扩增形式
多重PCR检测DMD基因缺失
PCR-RFLP法：(PCR产物限制性酶切片断多态性分析)
Ras癌基因
限制性内切酶
突变
限制性内切酶
正常
突变
电 泳
PCR技术应用于法医学鉴定
个体识别；亲子鉴定 方法：PCR-RFLP（限制片段长度多态性） DNA指纹 PCR-ASO （等位基因特异性寡核苷酸）
3.接通电源，选择合适的电压和时间电 泳。
实验材料
基因组DNA 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头， 微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X加样缓 冲液 ：Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液; Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液

PCR步骤
PCR技术进行时的实验步骤及关键点。
1 准备反应体系
准确配制反应体系，对反应结果有决定性的 影响。
2 初始变性
94℃高温变性DNA，断与模板DNA结合，为复制DNA段提供模板。
中温度下，聚合酶按照引物模板，从5' 到 3' 延长新DNA链。
PCR反应体系与条件
PCR反应体系和条件对PCR反应质量的影响及优化方法。
反应体系
PCR反应液的主要成分是DNA模 板、引物、酶和缓冲剂等。
反应条件
包括温度、时间、酶的用量，不 同反应条件对反应结果有着明显 的影响。
优化方法
PCR后期的处理包括电泳分析、 测序等，也是PCR发现和应用的 重要方面。
PCR应用领域
PCR技术最新的应用案例及特点和优势。
1
鉴定GMO
利用PCR技术提供检测和确定转基因技术应用在食品中的程度和情况。
2
疫情监测
PCR技术在病原体检测、疫情监测等方面有广泛应用。
3
医学诊断
PCR技术已成为临床医学检测中最敏感的检测技术之一，成为诸多疾病的确诊手段。
PCR技术发展和创新
PCR技术的发展历程及当今应用的新技术和新方法。
蓝光PCR技术
利用DNA和RNA在紫外光和 蓝光照射下的发光原理进行 检测。
实时荧光定量PCR技术
将定量PCR与荧光检测技术 相结合，能够准确快速地检 测样本中的目标序列。
数字PCR技术
将PCR反应分隔为大量微小 空间进行，可有效减少标准 曲线算法的误差和PCR非特 异性增长的影响。
PCR技术的优缺点和局限性
无处不在
在病毒、遗传疾病的诊断和育种等领域都有广泛应用。

体内DNA的复制体系
5’ 3’
拓扑异构酶 解旋酶类 SSB
DNA聚合酶（I II III）
引物 dNTP Mg2+
Mullis的PCR构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 60 性 40
（2）引物长度以15-40 bp为宜。
（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。
（4）引物内部避免形成二级结构。
（5）两引物间避免有互补序列。
（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
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（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
PCR的应用
1、特定DNA片段（基因、调控序列）的鉴定、分离 或制备。
A、DNA
B、cDNA
2、基因表达分析（原位、离体）
A、基因是否表达
B、基因表达水平高低
3、基因突变
基因克隆（ＲＴ－ＰＣＲ）
逆转录酶
mRNA 杂交双链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
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原位ＰＣＲ分析基因表达的组织特异性
浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反 应产量
dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA 聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等 的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。

（4）循环次数 主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
次数过多：非特异扩增增加
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（三）PCR产物的积累规律
在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学 原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的 DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对 稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到 达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、 PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产 物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般 要进行25次以上PCR循环。
PCR技术原理及其应用
§1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用
第一节 PCR技术原理
2
一、PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
合成引物
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
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PCR产物的积累规律示意图
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五、PCR引物的设计
（一）一般原则
①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特 异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合 成引物的成本增加。
②引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的 嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在 45～55％左右。
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③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以 免形成二聚体。
④引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变 性。
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⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任 何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产 物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。 ⑦引物与非扩增序列的同源性不应超过70％。