PCR-实验原理

PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：将PCR反应的试管与反应板紧贴。

当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在的PCR管中不能均匀传热。

不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。

对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。

没有扩增产物：在提供MgCl2缓冲液中，以L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。

泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR 反应中可能缺少游离的Mg2+。

检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。

检查模板和引物的用量。

增加循环次数和/或模板DNA的用量。

泳道中出现模糊条带：减少循环次数或模板DNA的用量。

提高退火温度，但不要超过68℃。

重新设计引物或设计更长的引物。

其他值得注意的条件：建议使用薄壁管。

厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。

大多数反应中，（~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。

建议使用L MgCl2∶350mmol/L dNTP或L MgCl2∶500mmol/L dNTP组合的混合物。

然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。

基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。

因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。

DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。

要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。

请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。

降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。

PCR技术原理、实验步骤和应用来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。

2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。

细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。

参与复制的有多种因素。

PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。

2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA 片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。

细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。

参与复制的有多种因素。

PCR 是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶0.5μL2、设置PCR反应程序。

实验三PCR扩增DNA【实验目的】1．掌握PCR扩增DNA的技术及原理2．学习PCR扩增仪的使用【实验原理】聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外DNA扩增技术，1985年由Mullis等人创立。

该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点，目前已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段，另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。

PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。

PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。

反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。

PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。

这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，假设PCR的效率为100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。

PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。

常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃，复性温度为37℃～55℃，延伸合成温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），反应循环数为30。

【实验材料】1.实验器材PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，经高压灭菌后的Eppendorf管，电泳仪。

2.实验试剂（1）模板DNA（0.1µg/µl）：用牙签挑取单菌落悬浮到50µl的裂解液中（裂解液1%TritonX-100，20mmol/l Tris-HCl PH 8.2, 2mmol/l EDTA）, 95℃温浴10分钟, 10000rpm离心5分钟,取2µl上清液用于总体积50µl的PCR反应。

PCR实验：扩增某种基因序列实验名称：PCR实验——扩增某种基因序列实验原理：PCR技术利用DNA聚合酶（Taq polymerase）在特定条件下，在模板DNA的引导下，逐渐扩增目的DNA片段，使其从极少的数量增加到可以检测的程度。

PCR反应可以扩增目标DNA，也可以进行基因定量和基因分型等应用。

实验步骤：1.根据要扩增的基因序列设计引物，引物序列应与目标基因的两端互补。

一般引物长度为18-24个碱基。

2.准备PCR反应体系，按照以下比例加入试管中：模板DNA：10 ng/μl；引物：0.2 μmol/L；Taq polymerase：1.25 U/50 μl；dNTPs：0.2 mmol/L；PCR缓冲液：1×；MgCl2：1.5 mmol/L；水：加至50 μl3.加入模板DNA，引物，dNTPs，PCR缓冲液，MgCl2和水，混匀。

4.放入热循环仪，进行PCR扩增。

PCR反应条件如下：预变性：94℃，5 min 反应循环：94℃，30 s 50-60℃，30 s （引物退火）72℃，30 s-2 min（延长PCR产物）循环次数：20-40次终止延伸：72℃，10 min 保存：4℃或-20℃5.取出PCR反应管，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

将PCR产物和DNA分子量标记（marker）一起进行琼脂糖凝胶电泳，观察PCR产物大小和带型。

根据产物大小和标记带大小，可以判断PCR反应是否成功，并计算出目标基因的大小。

6.如果需要测序，可以将PCR产物纯化后送测序。

注意事项：1.实验室应该保持清洁，避免污染DNA样品。

2.实验前应该准备好试剂和器材，避免出现时间延误。

3.引物的设计应该准确，长度应该合适，否则可能会影响PCR扩增的结果。

4.PCR反应条件应该严格控制，避免过度扩增或反应时间不足。

5.电泳实验时，应该注意安全，避免电流反转、漏电等事故发生。

6.电泳后，试管和电泳仪都要彻底清洗干净，避免污染实验器材。

PCR技术原理实验步骤和应用PCR(聚合酶链式反应)是一种体外复制DNA的技术。

它是通过复制DNA片段的方式，将少量的DNA扩增成数百万份，以供后续实验使用。

PCR技术的原理、实验步骤和应用如下所述。

一、PCR技术原理：1.变性：在这一步骤中，DNA样本被加热至高温（95-98°C），使双链DNA变为单链DNA。

这一步将断裂氢键，使双链分离。

2.退火：在这一步骤中，PCR反应混液降温至适宜的温度（55-72°C），引入一对特异性引物。

引物是短的DNA片段，它们被设计成与所要扩增的DNA片段的两个互补序列相匹配。

3.延伸：在这一步骤中，混合物再次升温至酶的最佳工作温度（72°C），以便DNA聚合酶可以结合到引物的3'末端，并以引物作为模板合成其互补链。

这个步骤会在每个引物上生成新的DNA链，并将引物的3'末端作为延伸的起始位点。

通过重复这个循环，PCR可以迅速和大量地复制DNA片段。

每周期（cycle）都会形成一倍的DNA数目。

根据PCR循环数的增加，DNA的数量呈指数性增加。

这种复制DNA的方式使得科学家能够扩增特定的DNA片段。

二、PCR技术实验步骤：PCR实验的主要步骤包括：2.准备PCR反应混合液：PCR反应混合液包括模板DNA、引物、DNA 聚合酶、缓冲液、MgCl2、dNTPs等。

这些成分的比例需要根据具体实验的要求进行调整，以确保最佳的反应条件。

3.设置PCR反应程序：根据所需的PCR循环数和反应条件，设置PCR 反应程序。

这涉及到变性、退火和延伸步骤的温度和时间等参数。

4.进行PCR扩增：将PCR反应混合液加载到热循环仪中，进行PCR扩增反应。

热循环仪会自动进行循环升温和降温操作，以完成PCR循环的过程。

5.分析PCR产物：通过凝胶电泳、实时荧光PCR或测序等方法，分析PCR反应产物的大小、纯度和数量等。

6.保存PCR产物：PCR产物可以储存以备后续实验使用，如测序、克隆、表达等。

pcr反应实验报告篇一：聚合酶链式反应PCR实验报告实验二聚合酶链式反应（PCR）一、实验原理聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。

它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。

从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物。

二、器材与试剂1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪2.试剂：引物，模板，T aq DNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O, 2*PCRmix溶液，DNA染料三、实验步骤PCR反应体系的建立取离心管，依次加入试剂混匀1．H2O 12μl2．模板1μl3．引物T7 1μl4．引物sp61μl5．2*PCRmix15μlPCR仪的热循环反应把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2. 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至56℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3. 引物的延伸：经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在T aqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复该循环30次，每次需要2-3分钟。

电泳检测结果扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。

四、讨论1. Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

PCR-SSCP实验原理和操作步骤(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism)【实验目的】1．了解PCR-SSCP技术的原理。

2．了解并熟悉PCR-SSCP技术的步骤。

【实验原理】PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。

它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。

PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。

PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。

其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。

因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。

为了便于观察分析结果，PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物，电泳后放射自显影观察泳动带的位置。

目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带，此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤，但其灵敏度不如用同位素标记。

单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关，但也受到其他条件的影响。

因此，PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件，如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。

PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性，一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。

【实验用品】1．PCR扩增仪；聚丙烯酰胺凝胶电泳装置；电泳仪；电泳槽。

2．6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（49：1）、1´TBE、10%过硫酸铵、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液、琼脂糖3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。

pcr实验的基本原理
PCR，全称为聚合酶链式反应，是一种在生物体外复制特定DNA的实验技术。

其基本原理是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度
至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物、DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。

然而，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA
聚合酶，这不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。