PCR技术原理简介ppt课件

6. 碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其 是3’端不应超过3个连续的G或C。
7. 引物自身不能有连续4个碱基互补，否则引物自身会折 叠成发夹结构影响引物本身复性。
14
反应体系
引物设计的原则：
8. 引物之间不能有连续4个碱基互补，避免两条引 物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物 二聚体，产生非特异性的扩增条带。
浓度过高可加速反应速度，同时增加碱基的掺入率和实验 成本，浓度过低又会降低反应速度，但可提高实验的精准 性。
18
反应体系
（四）模板（靶基因，target gene）
PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为模板用 于PCR反应。但为了保证反应的特异性，一般还宜用微 克水平的基因组DNA或104拷贝的扩增片段作为起始材料。
2. 产物不能形成二级结构：某些引物无效的主要原因是扩 增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二 级结构区域。
3. 引物长度一般为 15-30bp左右。引物的有效长度不能大于 38 ，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温 度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性。引物过短 也会使特异性降低。
2013/3/21
1
PCR是由美国科学家Kary B. Mullis 提出的一种体外简化 条件下模拟DNA体内复制的 DNA快速扩增的方法，获得 1993年诺贝尔化学奖。
2
目录
1 2 3 4
基本原理 PCR反应体系 实验流程 PCR的应用
3
一、基本原理
基本原理
聚合酶链反应（ polymerase chain reaction ，
及Mg2+存在的条件下，5’ 3’的聚合酶催化以引物为起始 点的DNA链延伸反应。
7
PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
基本原理
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
8
1个 PCR 循环完成后得到2个拷贝的靶序列
基本原理
9
n次循环后靶序列扩增的数量为2n
基本原理
循环次数 DNA扩增数
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
19
（五）反应缓冲液
反应体系
PCR缓冲液为反应提供所必须的合适的酸碱度和某些离子， 目前最常用的缓冲液是10-50mmol/L的Tris-HCl。
Tris-HCl
10-25mmol/L
KCl
50mmol/L
MgCl2
1.5mmol/L
明胶或牛血清白蛋白 100ug/ml
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高反应特异性降低，出 现非特异扩增； 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性， 使反应产物减少。
PCR ）：简称PCR技术，是一种体外扩增特异性DNA 片段的技术，其基本工作原理是以拟扩增的DNA分子 为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为 引物，在DNA聚合酶的作用下，通过变性-复性-延 伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板大量扩增。
4
基本原理
变性(denaturation):通物设计的原则：
4. 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果 不佳， G+C 过多易出现非特异条带。四种碱基分布最好 是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
5. Tm值最好接近72℃：以使复性条件最佳。Tm一般低于 有效启动温度5~10℃，也可按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估计Tm值。
键断裂，双链解离成单链DNA 模板
模板
5
基本原理
退火（annealing）:当温度降低时由于模板分子结
构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于 模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而 模板DNA双链之间互补的机会较少
6
基本原理
延伸(extension):在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核酸底物
9. 引物的延伸从3’端开始，3’端不可修饰，而 引物5’端可以修饰，如加酶切位点、标记生物 素、引入突变位点等。
10.引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及 倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导 致PCR失败。切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好
处
15
反应体系
引物量：
PCR反应中引物的浓度一般为0.2 ~ 1umol，以最低引物 量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和 非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会
11
反应体系
（一）寡核苷酸引物
引物是PCR特异性反应的关键； PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度； 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设
计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在 体外大量扩增。
12
反应体系
引物设计的原则：
1. 引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性：引物与非 特异性扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补 碱基同源。
16
反应体系
（二）耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌yT1株分离提取的， Taq DNA聚合酶它的最适反应温度在75℃左右，在 95℃的高温具有良好的热稳定性。
在100ul PCR反应体系中。一般约需加入酶量 2-4U， 足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的速度。
……
……
30
230
n
2n
10
二、PCR反应体系
反应体系
PCR反应五要素：
特异性寡核苷酸引物（Primer） 耐热DNA聚合酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） DNA模板（Template） 反应缓冲液（Reaction buffer）
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物 量减少。
Taq DNA聚合酶具有5’ 3’聚合酶活性和5’ 3’外切酶 活性，而无3’ 5’外切活性，因而没有校正功能，碱基 配错率为2.1 ×10-4 。
17
反应体系
（三）dNTP
在PCR反应中，dNTP应为 50～200umol/L，尤其是注意4种 dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓 度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。