基于对氨基苯甲酸_硫堇_纳米金共价修饰玻碳电极的葡萄糖生物传感器

2011年第69卷化学学报V ol. 69, 2011第12期, 1457～1462 ACTA CHIMICA SINICA No. 12, 1457～1462qulingbo@*E-mail:Received June 27, 2010; revised November 14, 2010; accepted February 27, 2011.1458化学学报V ol. 69, 2011传感器迫在眉睫. 再者, 葡萄糖氧化酶因其具有重要的生物催化活性且其价格便宜, 稳定性好, 实用性强, 所以它也是人们常用的制备酶传感器的理想模型分子. 本实验通过共价键合的方式来构建葡萄糖传感器, 与传统的基于静电或氢键组装多层膜[1～7]相比, 该方法能够极大地提高传感器的稳定性.1 实验部分1.1 试剂葡萄糖氧化酶(GO x)、氯金酸(Hydrogen tetrachloro- aurate hydrate, HAuCl4•3H2O)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购于sigma公司; 对氨基苯甲酸(4-ABA)、高碘酸钠(NaIO4)、半胱氨酸(L-Cys)购于中国医药上海化学试剂公司; 羟基二茂铁(Ferrocenemethanol)购于Alfa Ae-sar; 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)购于阿拉丁试剂有限公司, 其它试剂均为分析纯, 所有试剂未经进一步纯化. 实验用水为石英二次蒸馏水. 1.2 仪器设备及测试方法电化学实验在RST5000电化学测试系统上进行, 电化学池采用三电极系统: 玻碳电极为工作电极, Ag/AgCl (内含饱和KCl)电极为参比电极, 铂丝电极为对电极. 实验前GCE依次用0.5和0.3 µm的Al2O3抛光, 并依次在1∶1 HNO3[V(HNO3)∶V(H2O)], 无水乙醇及二次水中分别超声5 min. 循环伏安实验在静止的体系中进行. 葡萄糖储备液配好后需放置24 h, 以便完成构型转换. 所有溶液在电化学实验前均需通氮气30 min, 以消除溶液中溶解氧的影响.1.3 实验原理及过程众所周知, 羧基(-COOH)经EDC活化后可在温和条件下与氨基(-NH2)形成稳定的酰胺键; 氨基(-NH2)与醛基(-CHO)能在温和条件下发生Schiff碱反应, 此反应不需要加入任何催化剂, 在室温条件下即可顺利进行; 另外纳米金粒子能够与巯基产生稳定的Au-S共价作用. 我们就利用这三种共价反应来组装葡萄糖氧化酶的多层膜电极.葡萄糖氧化酶的醛基化处理: 葡萄糖氧化酶表面醛基化处理参照文献资料[8], 利用高碘酸钠将葡萄糖氧化酶表面醣基氧化为醛基. 首先将葡萄糖氧化酶(74.4 mg)溶解于10 mL磷酸盐缓冲液(pH 6.9)中, 冰水浴控制体系温度在4 ℃左右, 小心加入高碘酸钠(NaIO4) 120 mg, 搅拌条件下使反应进行90 min; 然后将体系温度升至25 ℃, 加入31.1 µL乙二醇阻聚, 溶液继续搅拌45 min, 反应停止, 产物为黄色溶液; 将产物移入渗透膜中, 用缓冲溶液渗透, 以除去小分子杂质. 整个反应需在避光条件下进行, 最后得到浓度约为40 µmol/L的醛基化的葡萄糖氧化酶. 产物需避光、冷冻保存.1.4 金纳米粒子的合成实验所用的纳米金粒子按文献[9]的方法合成: 将所有玻璃仪器用王水(浓盐酸∶浓硝酸＝3∶1, V/V)浸泡24 h, 二次蒸馏水充分洗涤, 自然晾干. 取1 mL 1%(体积浓度)的氯金酸溶液加入79 mL去离子水, 得A溶液; 分别取4 mL 1%的柠檬酸三钠溶液与0.05 mL 1%的鞣酸溶液, 将二者混合, 并加入16 mL去离子水得B溶液. 将A和B两种溶液分别加热到60 ℃, 在剧烈搅拌下迅速将二者混合, 待溶液变成红色, 再将溶液继续加热至沸腾10 min, 置于室温下冷却后即得金纳米粒子的溶胶. 将所得的金溶胶置于棕色容量瓶中, 置于4 ℃条件下保存.1.5 葡萄糖氧化酶电极的制备采用电化学生长法将处理好的玻碳电极在 1 mmol/L的4-ABA溶液中进行循环伏安扫描直到基线稳定[10], 如图1所示. 从图中可以看到在第一圈循伏安环扫描过程中大约在0.8和0.9 V处出现了两个氧化峰, 这与在玻碳电极面上共价键合对氨基苯磷酸的过程相似[11]. 在4-ABA溶液处理后电极需用二次水彻底冲洗, 并超声 5 min, 以除去电极表面的物理吸附[12]. 经过电化学生长法处理过的玻碳电极置于含3×10－2 mol/L EDC (由于EDC较易变质[13], 所以每次使用时均应新鲜配制)和3×10－2 mol/L NHS的pH＝6.8的磷酸盐缓冲盐中, 于60 ℃下活化15 min, 蒸馏水冲洗并用高纯氮气吹干后置于 1 mmol/L硫堇溶液中进行循环伏安扫描, 直到基线稳定, 取出后用蒸馏水冲洗, 氮气吹干; 转入醛基葡萄糖氧化酶溶液中浸泡 2 h, 第一层葡萄糖氧化酶通过与电极表面硫堇上的氨基发生Schiff碱作用被固载到电极表面, 电极外层裸露出未反应的醛基; 取出电极, 蒸馏水冲洗, 氮气吹干后再浸入半胱氨酸溶液中, 半胱氨酸的氨基与葡萄糖表面残余的醛基再形成Schiff 碱, 半胱氨酸另一侧的巯基裸露在电极表面; 再将电极浸入金胶溶液中(金纳米粒子的合成采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备), 金纳米粒子通过与电极表面的巯基间强的共价作用被固载到电极表面; 如此重复一次, 我们便可获得双层葡萄糖氧化酶修饰电极. 为保持葡萄糖氧化酶的活性, 组装需在4 ℃冰箱中进行, 且电极制成晾干后于4 ℃下在磷酸盐缓冲液上方悬挂保存.2 试验方法本实验采用三电极体系: 葡萄糖氧化酶电极为工作电极, Ag/AgCl电极为参比电极, 铂丝电极为对电极. 本No. 12 牛真真等：基于对氨基苯甲酸/硫堇/纳米金共价修饰玻碳电极的葡萄糖生物传感器1459图1裸玻碳电极在含有1 mmol/L 4-ABA的KCl (0.1 mol/L)溶液中的循环伏安图Figure 1Cyclic voltammograms of a freshly polished GCE in 0.1 mol/L KCl aqueous solution containing 1 mmol 4-ABA, from top to bottom: 1st, 2nd, 3rd and 5th cycles. Scan rate: 10 mV/s实验采用循环伏安和计时电流方法探讨了电极对葡萄糖的响应性能.3 结果与讨论3.1 羟基二茂铁在溶液中的电化学特性生命活动中许多重要的反应都与电荷的转移密切相关. 对酶传感器来说, 由于它的氧化还原基团被多肽链所包围, 阻碍了其与电极间的电子转移. 为了实现酶电极对葡萄糖的电催化功能, 必须使用电子媒介体来帮助实现其电子转移. 该实验中, 我们选择了羟基二茂铁作为电子转移媒介体. 首先来研究一下工作电极在羟基二茂铁溶液中的电化学行为.图2为玻碳电极(Φ＝3 mm)在含有不同浓度羟基二茂铁的磷酸盐缓冲液中(0.1 mol/L, pH 6.8)的循环伏安曲线. 由图可知羟基二茂铁的氧化还原电流随羟基二茂铁浓度的增大而增强. 由于较高浓度的媒介体易产生大的背景电流给检测造成困难. 因此我们采用媒介体的浓度为0.3 mmol/L.图3为组装了四层葡萄糖氧化酶的玻碳电极(Φ＝4 mm)在0.3 mmol/L羟基二茂铁的磷酸盐缓冲液中(0.1 mol/L, pH 6.8)不同扫速下的循环伏安曲线, 在195 mV 至270 mV范围内均有一对可逆的氧化还原峰出现. 该峰应归属于羟基二茂铁的电子氧化还原反应, 峰电位几乎不随扫速的变化发生变化, 且氧化峰与还原峰的峰电流均与扫速的平方根成正比(10 mV/s), 这说明羟基二茂铁在多层膜内的电荷传输符合扩散定律, 即羟基二茂铁在酶电极上的电极反应是受扩散控制的. 图2玻碳电极在含有不同浓度羟基二茂铁的磷酸盐缓冲液中(0.1 mol/L, pH6.8)的循环伏安图Figure 2Cyclic voltammograms of GCE in 0.1 mol/L PBS (pH 6.8) containing different concentrations of ferrocenemethanol. Inset plots of oxidized peak currents vs. the concentrations of ferrocenemethanol. (a) 0.1 mmol/L, (b) 0.2 mmol/L, (c) 0.3mmol/L.图3组装了四层葡萄糖氧化酶的玻碳电极在0.3 mmol/L羟基二茂铁的磷酸盐缓冲液中(0.1 mol/L, pH 6.8)不同扫速下的循环伏安图Figure 3 Cyclic voltammograms of four GOD bilayers modi-fied GCE in 0.1 mol/L PBS (pH 6.8) containing 0.3 mmol ferro-cenemethanol at different scan rates: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80 and 100 mV/s (from inside to outside), respectively. Inset plots of oxidized peak currents vs. the square root of scan rate3.2 以羟基二茂铁为媒介体的葡萄糖生物传感器的测定机理我们研究了酶电极对葡萄糖的催化氧化作用. 图4是酶电极在含有0.3 mmol/L 羟基二茂铁的磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L, pH 6.8)中的循环伏安曲线. 当电极上组装上葡萄糖氧化酶后, 氧化峰急剧增大, 还原峰减弱甚至消失.1460化学学报V ol. 69, 2011图4酶电极在含有0.3 mmol羟基二茂铁以及20 mmol葡萄糖的PBS (0.1 mol/L, pH6.8)中的循环伏安图Figure 4 Cyclic voltammograms of the GO x/Au NPs multilay-ered electrodes in the presence of 20 mmol glucose and ferro-cenemethanol (0.3 mmol) was used as a diffusional electron- transferring mediator. (a) (GO x)0, (b) (GO x)2这表明该反应是一个典型的酶促反应, 酶催化过程如(1)～(3)所示. 首先, 底液中的葡萄糖扩散到酶膜内, 被葡萄糖氧化酶氧化为葡萄糖内脂, 酶自身被还原; 其次, 电子媒介体羟基二茂铁扩散到膜内, 它的氧化型将葡萄糖氧化酶的还原型氧化为原始的葡萄糖氧化酶, 而媒介体本身被还原为Fc; 最后羟基二茂铁在电极上失去电子被氧化, 导致了羟基二茂铁的循环伏安图发生了明显的催化特征[14,15].Fc ZZ XYZZ Fc＋＋e (1) GO x(FAD)＋G ZZ XYZZ GO x(FAD-G)⎯⎯→GO x(FADH2)＋GL (2) GO x(FADH2)＋2 Fc＋⎯⎯→GO x(FAD)＋2 Fc (3) Fc and Fc＋: reduced and oxidized forms of ferrocenyl mediatorGO x(FADH2) and GO x(FAD): reduced and oxidized forms of periodate-oxidized glucose oxidaseG and GL: glucose and glucono-lactone3.3 pH值对酶传感器的影响pH值对酶催化反应及酶的活性有重要影响. 参考文献[16, 17]可知在pH 6.0～7.0之间时葡萄糖氧化酶的活性最大. 所以我们在pH值从6.0到7.0范围内的磷酸盐缓冲液中, 固定媒介体和葡萄糖浓度, 测试不同pH 值下响应值的变化. 当pH值小于6.8时, 随pH值升高, 传感器的响应值也逐渐增加; 在pH 6.8时, 电流的氧化峰值达到最大值; 当pH值大于6.8时, 响应值减小, 所以本实验选择pH值为6.8的磷酸盐缓冲液为底液. 3.4 温度对酶电极的影响温度是影响酶催化反应的一个重要因素. 酶的活性图5酶传感器在含有0.3 mmol/L羟基二茂铁与20 mmol/L 葡萄糖的PBS (0.1 mol/L)溶液中在不同pH值下的响应值(25℃)Figure 5Dependence of response current on pH value for fab-ricated glucose biosensor in 0.1 mol/L PBS (pH 6.8) containing 0.3 mmol ferrocenemethanol at 25 , the gl℃ucose concentration is 20 mmol/L.也与温度有直接关系, 如图6所示, 温度升高时, 酶催化反应速度增加, 氧化电流响应值增大. 葡萄糖氧化酶活性保留的温度范围为0～38 ℃, 最佳温度范围为20～25 ℃[18]. 综合考虑电极的灵敏度及其使用寿命, 本实验温度选择25 ℃.图6在不同温度下修饰有双层葡萄糖氧化酶的玻碳电极在含有0.3 mmol/L羟基二茂铁和20 mmol/L葡萄糖的测试液中的循环伏安图Figure 6 Cyclic voltammograms of GCE/(GOD)2 electrodes in 20 mmol Glucose solution containing 0.3 mmol ferrocenemetha-nol at different temperatures, (a) 20 ℃; (b) 25 ℃;(c)30 ℃3.5 含有不同层数葡萄糖氧化酶的电极对葡萄糖的电催化氧化图7表示修饰了不同层数葡萄糖氧化酶的玻碳电极在含有20 mmol/L葡萄糖和0.3 mmol/L的羟基二茂铁的PBS (0.1 mol/L, pH 6.8)中的循环伏安图, 从图中可知,No. 12牛真真等：基于对氨基苯甲酸/硫堇/纳米金共价修饰玻碳电极的葡萄糖生物传感器1461随着葡萄糖氧化酶层数的增多, 检测电流也在增大.图7 修饰了不同层数葡萄糖氧化酶的玻碳电极在含有20 mmol/L 葡萄糖和0.3 mmol/L 的羟基二茂铁的PBS 中的循环伏安图Figure 7 Cyclic voltammograms of the modified GCE in 20 mmol glucose/0.3 mmol ferrocenemethanol. (a) zero; (b) one and (c) two bilayers of GOD3.6 酶电极稳定性分析我们将组装了两层葡萄糖氧化酶的酶电极在0～0.5 V 范围内连续扫描, 以0.3 mmol/L 羟基二茂铁为电子转移媒介体, 支持电解质为0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH ＝6.8), 在20 mmol/L 葡萄糖存在下, 连续扫描50圈, 催化氧化电流没有明显下降. 在电极不用时, 将该电极置于0～4 ℃冰箱中并悬置于pH 6.8的磷酸盐缓冲液上方, 经过40 d 后, 对电极进行测试, 电极对葡萄糖的电流响应几乎没有改变(图8). 这说明该电极具有很好的稳定性. 良好的稳定性一方面归功于各层膜之间牢固的共价相互作用; 另一方面, 膜电极的组装是一个温和的过程, 酶分子没有被破坏. 3.7 电极的重现性实验用同一支电极对浓度为20 mmol/L 的葡萄糖溶液重复测定了9次, 结果见表1, 测得的相对标准偏差为0.49%, 表明该传感器有较好的重现性. 3.8 线性范围和检测限在上述选定的最优条件下, 用计时电流法测定酶电极对葡萄糖的响应电流. 随着葡萄糖浓度生物增加, 稳态响应电流也随着增大. 该电极的响应电流与葡萄糖浓度在3×10－5～1×10－3mol/L (R 2＝0.9983)范围内呈线性关系, 以3倍空白值的标准偏差计算传感器的检测限为: 5.8×10－6 mol/L. 3.9 干扰试验在20 mmol/L 的葡萄糖溶液中分别加入1 mmol/L 的尿酸及1.5 mmol/L 的抗坏血酸溶液, 发现响应电流几乎不变. 表明该传感器具有一定的抗干扰能力. 如图9所示.图8 组装了两层葡萄糖氧化酶的酶电极在含有1 mmol/L 葡萄糖和0.3 mmol/L 的羟基二茂铁的测试液中在不同时间扫描的循环伏安图Figure 8 Cyclic voltammograms of GCE/(GOD)2 electrodes in 1 mmol/L Glucose solution containing 0.3 mmol/L ferro-cenemethanol at different time. (a) 2010/1/20 (b) 2010/3/13.10 血样中葡萄糖含量的测定将实验所制传感器用于实际血样中葡萄糖含量的检测, 测定结果见表 2. 由下表可知, 该实验所制传感 器检测的实际血样中葡萄糖的含量与其在医院中使用生化分析仪检测的结果非常接近.4 结论本文研制的葡萄糖生物传感器是将表面醛基化的葡萄糖氧化酶与硫堇以及半胱氨酸通过共价键合的方式层层组装在玻碳电极表面, 构造了一种酶自组装多层膜, 把它作为葡萄糖生物传感界面使用. 该方法简单易行, 双层膜电极具有共价键高度的稳定性, 纳米金粒子的引入, 增加了电极表面酶的固载量, 且改善了电极界面电子传递能力, 并且具有较低的检测限及较宽的线性范围.表1 重现性实验Table 1 Reproducibility of tests试验次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 平均值 葡萄糖浓度(×10－3 mol•L －1) 20.05 19.85 20.12 20.00 20.05 19.95 19.85 20.02 20.10 19.961462 化 学 学 报 V ol. 69, 2011图9 双层葡萄糖氧化酶修饰电极在含有20 mmol/L 葡萄糖和0.3 mmol/L 的羟基二茂铁的测试液中的循环伏安图(T ＝20 ℃) Figure 9 Cyclic voltammograms of GCE/(GOD)2 electrodes in 20 mmol/L Glucose solution containing 0.3 mmol/L ferro-cenemethanol at 20 . (a) without distractor, (b)℃ with some dis-tractors表2 实际血样中葡萄糖含量的检测结果Table 2 Results of the determination of glucose in human se-rum samplesSample number Measured byHospital/(mmol•L －1)Determined bybiosensor/(mmol•L －1) Bias/(mmol•L －1)1 3.05 3.11 ＋0.06 2 5.18 5.25 ＋0.07 3 7.857.92＋0.07References1 Gooding, J. 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