猪流行性腹泻病毒血清学监测和监视方法酶联免疫吸附测定(ELISA)的开发与验证

猪流行性腹泻病毒抗体（PEDV-Ab）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定猪血清，血浆及相关液体样本中流行性腹泻病毒抗体（PEDV-Ab）水平。

实验原理：本试剂盒采用双抗原夹心法测定血清或血浆中猪流行性腹泻病毒抗体（PEDV-Ab）。

用纯化的猪流行性腹泻病毒（PEDV）抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中流行性腹泻病毒抗体（PEDV-Ab）相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的流行性腹泻病毒（PEDV）抗原结合，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中猪流行性腹泻病毒抗体（PEDV-Ab）的存在与否。

样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

猪流感及其防治措施最近，甲型H1N1流感疫情成为国际性的公共卫生事件，引起了全球高度关注，对养猪生产和猪产品市场也带来了一定的影响。

为保证养猪业的健康持续平稳发展，有必要正确认识和掌握猪流感及其防治技术。

本次引起墨西哥等国甲型H1N1流感的病毒是由猪流感、人流感、禽流感的RNA组合起来的，是一种新的流感变异株，不同于我们以往所说的猪流感病毒。

以往所说的猪流感病毒，在世界各地都有，生猪感染后，往往发病率很高，但只要不继发其他传染病，死亡率就很低，病猪很快就康复。

现就猪流感的有关情况作一介绍：1.流行特点不同年龄、性别、品种的猪均可感染，潜伏期2天～7天。

病猪和康复猪是主要传染源，康复猪可带毒1个月～3个月。

主要通过飞沫经呼吸道传播，被污染的饲料和饮水也可间接传播。

猪流感一年四季均可发生。

近年来主要发生在晚秋、严冬及早春。

该病传播迅速，死亡率不高，一旦伴有继发感染，就会造成巨大的损失。

2.临床症状典型特点是发病急，传播快，1天～2天内大批猪发病。

表现为精神沉郁，食欲降低，体温升高至41℃～41.5℃，张口呼吸，呼吸急促，口流白沫。

眼、鼻有浆液性至黏液性分泌物，肌肉和关节疼痛，常卧地不起。

病程短，死亡率较低，如无并发症，多数病猪5天～7天恢复正常；如有并发症常引起死亡。

非典型发病时，传播慢，病原数量少，食欲降低，持续咳嗽，消化不良，瘦弱，病程较长。

妊娠母猪感染时，可通过胎盘感染造成流产，严重者引起死亡。

康复母猪产木乃伊胎，或子猪生后发育不良和死亡率增高。

3.病理变化鼻、喉、气管及支气管黏膜充血、肿胀，并覆有黏稠液体，小支气管和细支气管有渗出物。

胸腔蓄积多量混有纤维素样的浆液，纵膈、支气管淋巴结肿大。

肺脏尖叶、心叶、中间叶、膈叶的背部和基底部，呈紫红色，坚实、塌陷，而周围的肺组织则呈苍白色气肿状态，界限分明。

肺的间质增宽，并出现炎症变化。

心包腔蓄积混有纤维素样的液体。

胃肠黏膜呈现卡他性炎症，脾脏微肿。

4.诊断根据发病季节、传播速度快、发病率高、病死率低等特点，结合临床症状和病理变化可以作出初步诊断。

.elisa酶联免疫吸附实验报告一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。

借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。

待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。

二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。

常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。

由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化1 / 11.作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。

酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。

氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。

高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。

用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

猪流行性腹泻的流行特点、诊断和防控技术李明波;宋忠旭;董斌科;孙华;雷斌;郭锐;梅书棋【摘要】猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种猪的高度接触性传染病，感染猪以急性肠炎、水样腹泻、呕吐为主要特征。

20世纪80年代我国首次报道并鉴定猪流行性腹泻病毒，随后该病毒成为引起猪病毒性腹泻的常见病毒。

2010年底，由PEDV变异毒株引起的PED大规模暴发，给养猪业带来重大经济损失。

文章主要针对当前PED在我国的流行情况、诊断技术、疫苗和防控策略等方面进行阐述，以期给该病的防控提供借鉴和参考。

【期刊名称】《养猪》【年(卷),期】2016(000)005【总页数】3页(P89-91)【关键词】猪流行性腹泻;流行情况;诊断技术;防控【作者】李明波;宋忠旭;董斌科;孙华;雷斌;郭锐;梅书棋【作者单位】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430209;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430209;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430209;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉430209;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430209;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430209;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430209【正文语种】中文【中图分类】S858.285.3猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪的肠道传染病，不同年龄阶段的猪都可感染，本病对初生仔猪的危害最大，5日龄以内的仔猪，由于腹泻和呕吐而造成的严重脱水，发病率和死亡率可达100%。

猪流行性腹泻的防治一、概述猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种猪的急性肠道传染病，猪流行性腹泻病毒(PEDV)为冠状病毒科冠状病毒属的成员（引起猪传染性胃肠炎的病毒为冠状病毒。

其它病毒如轮状病毒、腺病毒、呼肠孤病毒以及肠道病毒等亦可引起猪的传染性腹泻）。

二、猪流行性腹泻病毒特点猪流行性腹泻病毒对乙醚，氯仿等敏感，对外界环境和消毒药抵抗力不强，一般常用的消毒药在一定浓度下都能杀灭该病毒。

猪舍的环境温度可影响猪体内病毒的繁殖，在8～12℃的环境中比30～35℃的环境中产生的毒价高，这可能是本病在寒冷季节流行的一个重要因素。

病毒不耐热，在4℃以上不稳定，56℃加热45分钟，65℃加热10分钟即死亡。

相反在4℃以下的低温，病毒可长时间的保持其感染性。

放在阴暗处历时7 天仍保持其感染力。

肠道内的病毒在-20℃可保存6个月，在-18℃保存 18个月仅下降一个对数滴度。

病毒在PH4～8稳定，PH2.5时则被灭活。

对光敏感，在阳光下曝晒6小时即被灭活。

紫外线能使病毒迅速灭活。

三、流行病学猪流行性腹泻病多发于寒冷的冬春季节，即11月至翌年4月之间。

有时夏季也可发生该病。

该病目前仅感染猪，未发现感染牛、羊等其它动物。

不同年龄的猪都可发病，哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪感染发病率 100％，成年母猪为15％～19％。

哺乳仔猪受害最严重，病死率可达50 ％以上，但以两周龄内哺乳仔猪易感染、死亡率最高。

与猪传染性胃肠炎症状相似，但猪流行性腹泻发病程度较轻、传播速度稍慢。

一般是有一头猪发病后，同圈或邻圈的猪在1周内相继发病，4～5周内传遍整个猪场，死亡率不高，有一定的自限性，经1个月左右流行恢复痊愈。

该病的传染来源主要是病猪和康复后带毒猪。

该病毒存在于病猪的各个器官、体液和排泄物（如粪便、呕吐物、乳汁、鼻分泌物以及呼出的气体等），但以病猪的小肠粘膜、肠内容物、肠系膜淋巴结和扁桃体含毒量最高。

在发病早期，呼吸系统组织和肾的含毒量也相当高。

应用高通量成像技术检测猪流行性谷长维[1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.农业农村部经济动物疫病重点实验室，吉林 长春 130112；3.吉林省维民知识产权代理事务所(普通合伙)，吉林 长春 130000]猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一种α-冠状病毒，可导致各年龄段猪暴发高度接触性肠道疾病[1]。

PEDV 自2013年在美国中西部出现以来，已在美洲大部分地区流行，使养猪业出现了重大的经济损失[2]。

流行区的控制措施是针对建立PEDV 母猪免疫力和控制PEDV 感染。

母源免疫在保护新生仔猪抵抗PEDV 感染中起关键作用。

商业性疫苗、肌内注射给药，只有在口服暴露于活的PEDV(反馈)后，才能够增强PEDV 的免疫力，这是实现强烈、快速、持久刺激肠道黏膜免疫的唯一途径[3]。

多项PEDV 抗体试验，包括免疫荧光试验(immunological fluorescence assay，IFA)、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、病毒中和(virus neutralization，VN)和荧光聚焦中和(fluorescence focus neutralization，FFN)[4]，特别是评估PEDV 中和抗体水平(VN、FFN)为评估和预测猪群免疫力提供了有价值的工具[5]。

VN 检测试剂盒在常规使用中存在固有的弱点：检测结果具有主观性，因为反应是由人评价的，检测的重复性受到细胞增殖和病毒复制的运行间变异的影响，并且涉及的生物过程通量较慢。

PEDV FFN 试验是VN 试验的改良版，由试验人员读取结果，并根据相对于对照样本的荧光减少解释响应。

具体而言，抗体滴度报告为最高稀释度的倒数，导致荧光聚焦单位(fluorescence focus units，FFU)相对于病毒对照孔减少超过90％。

猪流行性腹泻病毒的研究进展作者：敖清莹来源：《国外畜牧学·猪与禽》2024年第03期摘要：猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的传染病，具有传染性强、致病性高、易传播的特点。

主要感染肠道上皮细胞，引起肠道上细胞损伤，从而影响肠道的吸收功能，感染后，病猪会出现呕吐、腹泻、食欲下降等症状，严重时可能导致脱水、死亡。

本文从猪流行性腹泻流行病学、病毒基因组及结构、临床症状及诊断进展进行综述，旨在为猪流行性腹泻的防控提供参考。

关键词：PEDV；流行病学；诊断中图分类号：S852.61 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2024）03-0089-04猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的接触性传染病，具有传染性强、致病性高的特点，主要感染猪肠道上皮细胞，引起肠道上皮细胞的损伤，从而影响肠道的吸收功能。

感染后，发病猪会出现食欲下降、呕吐、腹泻等症状，严重时可能导致脱水、死亡[1]。

研究表明，不同年龄段的猪均会感染PEDV，但临床症状有所不同，新生仔猪较易感，且发病率和死亡率较高[2]。

1971年，PEDV首次被发现；1978年，Pensaert等[3]首次分离出PEDV的经典毒株PEDVCV777株；1988年，Hofmann等[4]通过Vero细胞连续传代，分离到PEDV。

在过去的三十年中，PEDV的肆虐使欧洲和亚洲养猪业遭受了相当严重的经济损失。

2013—2014年，美国、加拿大和墨西哥也相继报道了PED[5]暴发，仅一年时间就损失了近七百万头仔猪，占美国养猪业的10％[6]。

我国早在1973年报道了PEDV[7]，1984年，Xuan等[8]通过血清中和实验，首次鉴定出PEDV。