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明胶酶谱法详解

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Zymography
Provided by Hsu suo-wen
一。

用品
1.细胞培养或者提取组织
2.试剂的配制
（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶）
A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量）
10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 5ml（包括）
ddH2o 1.5ml
30%储备胶 （0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺） 1.65ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8） 1.25ml
10% SDS 50ul
10%过硫酸铵（AP） 50ul
TEMED 4ul
1%明胶 0.5ml(or 100ul)
(注意：天气如果较冷除TEMED，其他成分按顺序加完后要置于37度温育，最后加TEMED)
B.浓缩胶的配制-同Western Blot
浓缩胶 3ml
ddH2o 2.1ml
30%储备胶 0.5ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml
10% SDS 30ul
10%过硫酸铵 30ul
TEMED 3ul
（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）
（4）4 ×上样缓冲液20ml(不同于Western)
0.32% Tris-HCL 6.4ml 50mM Tris 0.606g
4%SDS（PH7.2） 8ml 2% SDS 0.2g
16%甘油 3.2 ml 10%甘油 10ml
溴酚蓝 0.024g 0.1%溴酚蓝 0.01g
ddH2o 2.4ml(20ml) (10mlsystem)
(5) 洗脱液（1L）:2.5% Triton X-100（25ml），50mmol/L Tris –HCl（6.06g），5mmol/L CaCl2（or 10mMol 1.11g），1μmol/L ZnCl2，pH7. 6
漂洗液（相比洗脱液，少了Triton）： 50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6
注意：洗脱液不能重复使用，必须现配，尽可能多加洗脱液，温育摇动时注意Triton有毒。

（7）孵育液（相比洗脱液，少了Triton，增加了Brij）：50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2（不影响PH）, 0. 02% Brij-35（or0.02%NaN3，W/V,剧毒） ,pH7.6
（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝 R-250，30%or40%甲醇，10%乙酸
（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%
二：步骤
1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。

1h
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。

与4×上样缓冲液（4%SDS，0.25 mmol/L Tris-HCl，40%甘油，0.1% 溴酚蓝）按照1∶3混合。

4.配制分离胶和浓缩胶，15ul/孔上样，注意所有操作必须在冰上操作，不能煮沸。

（根据表达强忍和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处改为90毫安恒流，直至溴酚蓝跑出胶外。

（1小时左右）。

5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2， 1μmol/L ZnCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次45分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。

6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD） 和MMP -9（92 KD） 为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。

注意事项：
1． 制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡 。

2． 明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液 配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3.刮蛋白时，用裂解液加PMSF, 其他不要，一定不加EDTA,其他同WB,蛋白
尽量在-80度保存，上样量不能太多，否则smear, 20-30ug足以。

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明胶酶检测方法研究进展_陈秋凤

明胶酶检测方法研究进展_陈秋凤

明胶酶检测方法研究进展陈秋凤1，周防震21．湖北民族学院附属医院（湖北恩施445000）2．湖北民族学院生物科学与技术学院（湖北恩施445000）【关键词】明胶酶；检测方法；进展【中图分类号】R739．87【文献标识码】A【文章编号】1008－8164（2012）01－0070－02明胶酶，亦称Ⅳ型胶原酶［1］、基底膜性胶原酶［2］等，属于基质金属蛋白酶（Matrix metalloprotein-ases，MMPs）范畴，包括明胶酶A（MMP－2或称72kDaⅣ型胶原酶）和明胶酶B（MMP－9或称92kDa Ⅳ型胶原酶），可降解Ⅳ型胶原、明胶和V型胶原等基底膜成分，在组织炎症［3］、纤维化［4，5］、免疫［6］与肿瘤转移［7 9］等诸多过程中发挥重要作用。

明胶酶检测方法从最初的明胶酶谱法到现在采用的ELISA 法，从粗略定性到逐渐发展为准确定量，方法稳定性、可靠性逐渐完善，操作也变得更为简单。

本文就明胶酶测定方法的研究进展进行综述。

1基于明胶酶催化活性的检测方法利用明胶酶能催化降解明胶的特点发展建立起来的检测方法主要有明胶酶谱法（Zymography）、荧光明胶酶法和DQ明胶（Dye－quenched－gelatin）原位酶谱法。

1．1明胶酶谱法Kleiner等［10］于1994建立此方法，是一种基于非还原SDS－PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法。

主要原理是：1）含明胶酶的样本首先上样进行非还原SDS－PAGE电泳，利用明胶酶与阴离子去垢剂SDS结合，形成蛋白质－SDS 复合物，使待测蛋白质带上相同的负电荷，其量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，此时蛋白质分子在凝胶中的迁移率取决于其分子质量大小；2）SDS－PAGE电泳后利用含阳离子去垢剂（Triton－x100）的洗脱液洗脱去除SDS，这一过程中引发了明胶酶酶原蛋白体外活化机制，酶原在凝胶内除掉一个约10kDa的小肽，转变为有活性的酶［11］，降解凝胶中相应部位的明胶。

明胶酶谱法 -回复

明胶酶谱法 -回复

明胶酶谱法 -回复明胶酶谱法是一种用于测定明胶酶活性的分析方法。

明胶酶谱法基于明胶酶对明胶的降解作用，通过测定明胶的降解程度来反映明胶酶活性。

这种方法可以在实验室中进行，通常需要一些特定的试剂和设备。

明胶酶谱法的原理是利用明胶对明胶酶的敏感性，通过观察明胶降解的速度来确定酶的活性。

在明胶酶谱法中，一般会选择特定浓度和分子量的明胶，以确保最佳的测定结果。

明胶酶谱法可以用来研究明胶酶对明胶的降解过程，了解酶的活性和特性。

这个方法可以应用于食品工业、制药工业等领域，用于检测明胶酶的活性和质量。

明胶酶谱法在实验室中的操作比较简单，但需要一定的实验操作技巧和对仪器的熟悉。

这种方法对明胶酶活性和测定结果的准确性有着重要影响，所以需要严格按照操作流程进行实验。

明胶酶谱法的操作流程包括样品制备、反应过程、数据记录等环节，需要仔细阅读方法说明书并进行实践。

在明胶酶谱法中，常用的数据处理方法有绘制酶活性曲线、计算酶活性单位等。

明胶酶谱法需要注意的问题包括试剂的质量、设备的准确性和对废液的处理等。

明胶酶谱法的优点是操作简便、结果准确可靠，可以在较短时间内完成分析。

明胶酶谱法的局限性在于它只是测定明胶酶活性的一种方法，不能全面了解酶的特性。

在明胶酶谱法中，一些因素如温度、pH值等会对酶的活性产生影响，需要进行恰当的控制。

明胶酶谱法的操作需要注意安全，避免对人体和环境造成伤害。

明胶酶谱法是一种常用的分析方法，被广泛应用于生物化学、食品科学等领域。

该方法在明胶酶的研究和应用中具有重要意义，可以帮助科学家们更好地了解酶的特性和机制。

明胶酶谱法的结果可以用于酶活性检测、比较不同酶样品的活性等。

这种方法还可以用于评估明胶酶的纯度和稳定性，指导生产过程中的酶的应用。

明胶酶谱法可以与其他分析方法结合使用，提高酶活性测定的准确度和可靠性。

该方法还可以用于研究明胶酶的底物特异性、抑制剂的效果等。

明胶酶谱法的发展使得对明胶酶的研究更加深入和全面。

酶谱法检测金属蛋白酶活性

酶谱法检测金属蛋白酶活性

原理酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。

静置于Trition中是不妥的。

）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。

2试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括）ddH2O 4.5ml30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml1.5mol/l Tris（PH 8.8）2.5ml10% SDS 100ul10%过硫酸铵（APS）100ulTEMED 8ul1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5mlB.浓缩胶的配制浓缩胶6mlddH2O 4.5ml30%储备胶0.75ml1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml10% SDS 60ul10%过硫酸铵60ulTEMED 6ul（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）（4）4 ×上样缓冲液0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS（PH7.2）8ml16%甘油3.2 ml溴酚蓝0.024gddH2O 2.4ml(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/LCaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液）（6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）3实验步骤1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

明胶酶谱法

明胶酶谱法

明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。

静置于Trition中是不妥的。

）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。

Mmp-2 72kd mmp-9 92kd实验步骤1.取对数期的癌细胞在的C。

2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。

3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。

与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。

（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。

5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。