猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究
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猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）引起的一种高度接触性传染病，俗称“猪蓝耳病”。
该病主要以引起母猪发热、厌食和流产、早产、木乃伊胎及弱仔等繁殖障碍及仔猪和生长猪出现呼吸系统疾病和高度死亡率为特征［１－２］。
ＰＲＲＳ于１９８７年首次在北美发现［３］，１９９１年在欧洲发生，并在荷兰首次分离到ＰＲＲＳＶ，命名为Ｌｅｌｙｓｔａｄ病毒（ＬＶ）［４］；美国于１９９２年分离到ＰＲＲＳＶ，命名为ＶＲ－２３３２［５－６］；郭宝清等［７］于１９９６年首次从我国疑似ＰＲＲＳ病猪中分离到ＰＲＲＳＶ，从而证实了ＰＲＲＳＶ在我国的存在。
该病可经水平和垂直两种方式传播，其流行已给养猪业造成了巨大的经济损失。
在１９９６年第十届国际病毒学大猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究刘永宏1，刘月焕2，王凤龙1，韩春华2，林健2，王金玲1，杨龙峰3，赵丽1，张秋雨4，张永富5（1.内蒙古农业大学动物科学与医学学院，内蒙古呼和浩特010018；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京100089；3.北京市延庆县动物卫生监督管理局，北京102100；4.北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司，北京1000431；5.内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古通辽028000）摘要：根据G enB ank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PR R SV)的O R F6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用R T-PC R方法扩增出PR R SV的O R F6基因（M基因)。
将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)，pET-O R F6重组质粒转化D H5a宿主菌后,经双酶切、PC R鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的O R F6基因序列进行分析。
结果表明, O R F6基因的原核表达载体构建成功。
O R F6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%，与LV株的同源性为79.9%，系统进化树表明该PR R SV属于美洲型。
将构建成功的重组质粒pET-O R F6转化B L21,诱导后经SD S-PA G E 和W est er n-bl ot分析表明：克隆在H I S标签的膜基质蛋白基因与H I S获得了高效表达，表达的融合蛋白H I S-M分子量约为39kD a，并且有免疫学反应活性。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；变异株；O R F6基因；克隆；原核表达中图分类号：S852.659.6文献标识码：A文章编号：1005－944X（2009）07－0029－04Cloning and Expression in E.coli of ORF6Gene of Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus VariantLiu Yonghong1,Liu Yuehuan2,Wang Fenglong1,Han Chunhua2,Lin Jian2,Wang Jinling1,Yang Longfeng3,Zhao Li1,Zhang Qiuyu4,Zhang Yongfu5(1College of Animal Science and Medicine,Inner Mongolia Agriculture University,Huhhot010018China;2Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing100097China;3Beijing Yanqing County Animal Health Supervision and Management Bureau,Beijing102100 China.;4Beijing DIHO Biomedicai Science＆Technology Co.,Ltd，Beijing，100043，China；5College of Animal Science and Technology，Inner Mongolia University For the Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia，028000，China.) Abstract：A pair of primers were designed and synthesized according to the ORF6gene sequences of Ameri-can genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)in GenBank.The ORF6gene(M gene) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)was amplified by RT-PCR.The amplified gene fragment was then cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a(+)，the recombinant plasmid was trans-formed into host cell DH5a,the selected positive clones were subjected to sequence analysis of the inserted ORF6 gene after double enzyme digestion and PCR identification.The result showed that the construction of the prokary-otic expression vector for ORF6gene was successful.The deduced amino acids of the cloned ORF6gene showed 96.0%～100%to LV.The phylogenetic trees revealed the strain was clustered within North American genotype. homology to North American strain and79.9%.The results of SDS-PAGE and Westem-blot indicated that the M protein gene cloned in the HIS-Taq was expressed in a high level and the recombinant fusion protein，which was about39kDa had immunologically reactive activity.Key words:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)；Variant；ORF6gene；Cloning and prokaryotic expression资助项目：北京市农林科学院青年基金项目(2007020122)、北京市科委猪高致病性蓝耳病防控技术子课题通讯作者：刘月焕，北京市农林科学院畜牧兽医研究所；王凤龙，内蒙古农业大学动物科学与医学学院会上，国际病毒分类委员会（ＩＣＴＶ）将猪繁殖与呼吸综合征病毒与马动脉炎病毒（ｅｑｕｉｎｅａｒｔｈｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＥＡＶ），乳酸脱氢酶升高症病毒（Ｉａｃ－ｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ－ｅｌｅｖａｔｉｎｇｖｉｒｕｓ，ＬＤＶ）和猴出血热病毒（ｓｉｍｉａｎｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ，ＳＨＦＶ），一起归属到新成立的套式病毒目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）动脉炎病毒科（Ａｒ－ｔｅｒｉｒｉｄａｅ）动脉炎病毒属（Ａｒ－ｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）中［８－９］。
ＰＲＲＳＶ病毒基因组长约１５０００ｎｔ，含８个开放阅读框架（ＯＲＦｓ）［１０］，Ｍ蛋白是由ＯＲＦ６编码的膜基质蛋白，分子量为１８－１９ｋＤａ，Ｍ蛋白是北美毒株间高度保守的，也是欧美毒株结构蛋白中最保守的蛋白，具有很强的免疫原性，感染后１０天即可检出Ｍ蛋白的特异抗体。
近来研究表明，Ｍ蛋白不仅可以诱导机体产生中和抗体，还能够诱发强的特异性细胞免疫应答［１３］。
因此，Ｍ蛋白常可作为诊断抗原来检测ＰＲＲＳＶ。
表达的重组Ｍ蛋白可以作为血清学试验的靶抗原［１１－１２，１４－１５］。
本实验以２００６年暴发ＰＲＲＳＶ的变异株ＯＲＦ６基因为研究对象，应用分子克隆技术对ＯＲＦ６基因进行扩增、构建原核表达载体、诱导表达蛋白，为进一步深入研究ＰＲＲＳ检测试剂盒奠定基础。
1材料与方法1.1材料1.1.1病毒、细胞及载体ＰＲＲＳＶ变异株（本实验室分离株ＢＪＳＹ－１）、ＭＡＲＣ－１４５细胞（本实验室保存），原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）由北京市庄笛浩禾生物医学有限公司提供，宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ、ＢＬ２１购自北京天根生化科技有限公司。
1.1.2主要工具酶及试剂ＤＭＥＭ培养基、犊牛血清购自ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司，Ｔｒｉｚｏｌ试剂为Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ产品，限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒（ＴａｋａｒａＲＮＡＰＣＲＫｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０）、胶回收试剂盒（ＴａｋａｒａＡｇａｒｏｓｅＧｅｌＤＮＡＰｕ－ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．０）、质粒小提试剂盒（ＴａｋａｒａｍｉｎｉｂｅｓｔｐｌａｓｍｉｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．０）、ＩＰＴＧ等购自大连宝生物工程有限公司。
蛋白质Ｍａｒｋｅｒ（ＭＰ１０２，ＭＰ２０４），考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液（ＰＡ１０１－０１），二抗（兔抗猪ＩｇＧ－ＨＲＰ），ＨＲＰ－ＤＡＢ底物显色试剂盒等购自天根生化科技有限公司。
猪高免ＰＲＲＳＶ阳性血清由中国农业大学杨汉春教授惠赠。
1.1.3主要仪器ＰＣＲ仪（ＭＪ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ），高速冷冻离心机（ＳＩＧＭＡ），水平电泳仪（ＪｕｎＹ－ｉ３００），ＤＹＹ－６Ｃ稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂），生物安全柜（Ｅｓｃｏ），ＣＯ２培养箱（Ｓａｎｙｏ），凝胶成像仪ＴＲＡＮＳＩＬＬＵＭＩＮＡＴＯＲ２０２０Ｄ，ＴＨＺ－Ｄ台式恒温振荡器（太仓市试验设备厂），ＮＤ－９４０５Ｂ水平摇床（北京市六一仪器厂）。
1.1.4引物设计根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＰＲＲＳＶ美洲型毒株序列，按照引物设计原则利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０自行设计了一对引物：上游引物ＰＭ１：５'－ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＧＴＣＴＣＴＡＧＡＣＧＡ－３'下游引物ＰＭ２：５'－ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＴＴＡＡＣＡＡＧＧ－３'为便于基因克隆及构建表达载体，分别在引物ＰＭ１及ＰＭ２的５′端加入ＢａｍＨＩ及ＸｈｏＩ酶切位点（引物中下划线部分），且在酶切位点前加了保护性碱基，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
