pTWINl-EgAgB8／3自剪切融合蛋白原核表达载体的构建及表达

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达张大伟;胡蕴玉;李立文;白文涛;杨香菊;李文献;白建萍【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2007(007)006【摘要】为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3/pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定.脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位.经酶切和基因测序鉴定LMP3/pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功.转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达.说明基因重组技术可成功构建LMP3/pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内.【总页数】4页(P972-975)【作者】张大伟;胡蕴玉;李立文;白文涛;杨香菊;李文献;白建萍【作者单位】第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;西北大学生命科学院生物科学系,西安,710069;第四军医大学微生物学教研室,西安,7100321;第四军医大学口腔医院正畸科,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】Q5【相关文献】1.遗传学：LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞中的表达 [J], 张大伟2.SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达 [J], 罗天霞;樊红琨;芮丹丹;孙佳翕;马小芳;章茜3.牛乳状瘤病毒13型pEGFP-E5-N1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 庞峰;史巧芸;朱华培;徐开莲;赵天靖;李亚颖;彭冬梅;李国华;周海龙4.水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 匡文华;王凤阳;张晓茹;成鹰;杜丽;雷明;焦寒伟;张冬琳;郝永昌;祁超5.pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达 [J], 徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

pBLacZ真核表达载体的构建及其在体内外的表达
屈伸;杨仕林
【期刊名称】《同济医科大学学报》
【年(卷),期】1996(025)001
【摘要】构建了一种编码β－半乳苷酶的真核基因表达载体ｐＢＬａｃＺ。

用它对体外培养的ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ－１、ＣＨＯ细胞株、原代培养的小鼠皮肤成纤维细胞，以及小鼠活体皮下和大鼠活体骨骼肌中进行了基因转移。

经Ｘ－ｇａｌ组织化学染色后的结果证实：此基因载体可在这些组织细胞中有效地表达产生β－半乳糖苷酶活性。

【总页数】4页(P5-8)
【作者】屈伸;杨仕林
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】Q782
【相关文献】
1.小鼠cofilin-1基因及其真核表达载体的构建与体内外表达 [J], 李玲玲;张伟;杜蕊;宋玲珍;柴学军;胡新德;陈树林;赵善廷
2.真核表达质粒PcDNA
3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)的构建及其在体内外细胞中的表达 [J], 刘建巨;关继奎;王琳;赵秀梅;郑建秋;李丹;闫庆慧3.人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应研究 [J], 王桂琴;兰晶;于培霞;邓志华
4.SJIR-2基因真核表达载体的构建及在真核细胞内表达的研究 [J], 王正印; 尹元; 陆群
5.人CD80基因的重组真核表达载体的构建及其在体内外的表达 [J], 熊宇芳;屈伸;邓耀祖;章洁;刘然义
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TAT-GFP-ERβ融合蛋白的原核表达与鉴定于林;王春雨;杨睿;王亮;石建党;张琚【期刊名称】《南开大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2008(041)004【摘要】从前列腺中提取总RNA,RT-PCR获得ERβ基因,将其联人pEGFP载体,得到重组质粒pEGFP-ERβ,再将上述质粒的GFP-ERβ片段亚克隆于pTAT-2.1质粒,形成pTAT-GFP-ERβ重组质粒.在BL21工程菌中IPTG诱导表达TAT-GFP-ERβ融合蛋白.用Western Blot鉴定纯化的融合蛋白的免疫原性.用纯化的蛋白转导事先转染ERE-Luc报道质粒的Hela细胞,用Luciferase Assay鉴定转导蛋白的生物学活性.证明TAT-GFP-ERβ蛋白具有完整的生物活性.【总页数】4页(P55-58)【作者】于林;王春雨;杨睿;王亮;石建党;张琚【作者单位】南开大学,生物化学与分子生物学系,天津,300071;南开大学,生物化学与分子生物学系,天津,300071;南开大学,生物化学与分子生物学系,天津,300071;南开大学,生物化学与分子生物学系,天津,300071;南开大学,生物化学与分子生物学系,天津,300071;南开大学,生物化学与分子生物学系,天津,300071【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定 [J], 苟冶然;龙小滨;白磊;何泉;陈检;张绍城;汪德强;周建中2.重组 GST-β-GT 融合蛋白的原核表达、纯化及活性鉴定 [J], 郭庆栋;李慎涛;张玉祥;贾弘褆3.ZHX2-GST融合蛋白原核表达载体的构建和鉴定 [J], 杜杨君;文剑明;吕自力4.HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定 [J], 邱会平;程晓东;卢春5.定点突变的猪源性胰高血糖素样肽-2融合蛋白的原核表达与鉴定 [J], 韩斐; 赵睿骁; 王刚; 江明锋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

GST-LMO1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达顾卉;佟宇鑫;刘彤;李慧;李丹妮;袁正伟【摘要】目的构建GST-LMO1融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LMO1基因全长及各个截短突变体,通过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,并用Western blot方法证实了GST-LMO1全长及各个截短突变体融合蛋白的表达.结论成功构建了LMO1全长及其截短突变体原核表达载体,并证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为LMO1结构与功能的研究提供了前提基础.%Objective To construct GST-LMO1 fusion protein expression vector and induce its expression in Escherichia coli(E.coli). Methods The coding sequence of LMOl and its deletion fragments were amplified from the human fetal brain as the template by PCR and inserted into pGEX-5X-2 by BamH I and EcoR I . The positive recombinants were identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. Then they were transformed into E.coli BL21, induced by IPTG and identified by SDS -PAGE and Western blot. Results The prokaryotic expression plasmid pGEX-5X-2-LM01 and its deletion mutants were successfully constructed and confirmed by enzyme digestion and sequencing. The GST-LM01 fusion proteins were expressedand confirmed by Western blot. Conclusion The prokaryotic expression plasmid of LMOl and its deletion mutants were successfully constructed and the expression of fusion proteins in Escherichia coli was con-finned. This study provides the basis for the further research on the structure and function of LMOl.【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2011(040)011【总页数】4页(P961-963,978)【关键词】LMO1;截短突变体;质粒;原核表达【作者】顾卉;佟宇鑫;刘彤;李慧;李丹妮;袁正伟【作者单位】中国医科大学附属盛京医院实验研究中心,沈阳110001;中国医科大学基础医学院细胞生物教研室,细胞生物学教育部、卫生部重点实验室,沈阳110001;中国医科大学基础医学院细胞生物教研室,细胞生物学教育部、卫生部重点实验室,沈阳110001;中国医科大学附属盛京医院实验研究中心,沈阳110001;中国医科大学第94期临床医学系,沈阳110001;中国医科大学附属盛京医院实验研究中心,沈阳110001【正文语种】中文【中图分类】Q257LMO家族是只包含LIM结构域的一类蛋白，由两个串联的LIM结构域构成。

融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化戚华兵;汪仕良;王凤君【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)22【摘要】目的构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1αPAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。

方法分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。

结果成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG 诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。

结论含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础。

【总页数】3页(P2213-2215)【关键词】原核表达系统;TAT蛋白转导结构域;缺氧诱导因子1α;PAS—B结构域【作者】戚华兵;汪仕良;王凤君【作者单位】第三军医大学西南医院全军烧伤研究所【正文语种】中文【中图分类】Q503;Q51【相关文献】1.抗凋亡融合蛋白 PTD－Bcl－xL 原核表达载体的构建及表达纯化 [J], 王晓晔;石博妹;王英群;李珣;刘徳玉;李铭;李芳芳;胡传活2.β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化 [J], 朱爱华;李敬;陆军;钱进;郑元林3.PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化 [J], 杜琴;蔡嘉镜;蒋春萍;徐磊;张国元;王东生4.HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定 [J], 邱会平;程晓东;卢春5.含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定 [J], 葛高霞;王平;卢春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

含P_RP_L启动子的原核高效表达载体的组建及其应用
张智清;姚立红;侯云德
【期刊名称】《病毒学报》
【年(卷),期】1990(6)2
【摘要】我们组建了一个含P_RP_L自动子的原核高效表达载体,它同时含有cI调控基因、多酶切点和两个强的转录终止序列。

带起始密码子ATG的外源基因可以插入启动子下游的多酶切点,表达非融合蛋白,产品可供临床使用。

我们实验室已用它成功地表达了人γ干扰素、人白细胞介素-2和人肿瘤坏死因子等,表达量均占菌体总蛋白的20％以上。

【总页数】6页(P111-116)
【关键词】表达载体;PRPL启动子;非融;合蛋白
【作者】张智清;姚立红;侯云德
【作者单位】中国预防医学科学院病毒学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q782
【相关文献】
1.表达产物可用IMAC快速纯化的原核表达载体的组建与应用 [J], 李福胜;贡惠宇
2.具全期启动子盒的杆状病毒高效表达载体的组建与应用 [J], 吴文言;王Xun章
3.果实特异性启动子驱动的含sbr基因植物高效表达载体的构建 [J], 赵玮玮;凌均棨;杨国平
4.含P_RP_L，Ptac双启动子表达载体的构建 [J], 董晨;华子春;董雪吟;陈于红;徐贤秀;朱德煦
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hIL—13融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
王文;田志刚
【期刊名称】《中国免疫学杂志》
【年(卷),期】1998(014)005
【摘要】通过ＲＴ－ＰＣＲ技术直接从激活的健康人外周血单个核细胞（ＨＰＢＭＣ）中扩增出的０．３ｋｂ的ｈＩＬ－１３基因片段，经ＤＮＡ重组技术，插入到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２中，转化入感受态的大肠杆菌ＴＧ１中，成功地构建了ｈＩＬ－１３的基因工程表达菌株ｈＩＬ－１３「ｐＧＥＸ－４Ｔ－２／ＴＧ１。

经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后表达的ＧＳＴ－ＩＬ－１３融合蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明分子量约３６ｋＤ、
【总页数】4页(P322-325)
【作者】王文;田志刚
【作者单位】山东省医科院山东肿瘤生物治疗研究中心;山东省医科院山东肿瘤生物治疗研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
【相关文献】
1.嗜铬颗粒蛋白B-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 油红捷;毋晓涛;潘颖;王泽生
2.重组人肝刺激因子非融合性蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化
[J], 刘贺佳;吴媛;杨琳;安威
3.融合蛋白表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 [J], 李莉;高秀来;宋一志;陆涛;景鹏
4.pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 张晓红;夏春波;刘源劼;蒋常文;门楠
5.rhIL-13表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达 [J], 王文;田志刚;孙汭;张建华
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原核表达体系的构建刘华彬，董浚键一、实验材料（1）植物材料：拟南芥（2）载体及菌株：克隆及测序用载体为pMD18-T，购自Takara公司。

宿主菌DH5α。

原核表达载体（pET30c ？）。

（3）PCR引物：登陆GeneBank查找目的基因序列，以目的基因序列为模板设计引物。

（4）药品试剂：反转录试剂盒（TaKaRa），质粒小提试剂盒（TIANGEN），胶回收试剂盒，Taq DNA聚合酶（TaKaRa），dNTPs（TaKaRa），限制性内切酶（TaKaRa），T4连接酶（TaKaRa），各种DNA和蛋白marker，各种抗生素类，二、方法（1）目的基因的获得（RT-PCR）：拟南芥叶片→mRNA→逆转录→cDNA→PCR →基因（详见王希朝那份）；PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。

先设计好PCR的引物和PCR的反应程序。

（2）克隆载体的构建：Ⅰ. 目的基因的切胶回收：①在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块，放入已称重的离心管中，在保证目的基因全部回收的同时，应尽量减少胶的体积。

②计算凝胶重量（100 mg相当于100 μl），加入3倍体积solution DE-A，75℃水浴6-8分钟，其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。

③加入2倍体积solution DE-B，颠倒混匀，将溶液转移到吸附柱中，室温放置1 min，12000 rpm离心1 min。

④取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入600 μl Wash solution，室温12000 rpm离心30 s。

⑤重复步骤④一次。

⑥取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000 rpm离心1 min。

⑦将吸附柱放入新的1.5 mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入30 μl 75℃预热的ddH2O，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。

离心管中的液体即为回收的目的基因片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

Ⅱ. 目的片断与克隆载体pMD18-T连接：pMD 19-T Simple Vector（T载体，小纸盒子中）1ulInsert DNA 2ul 5uldH2O 2ulSolution I（冰中融化，小纸盒子中，跟T载体一起）5ul（等量）16℃反应30minⅢ. E. coli DH5α感受态细胞的制备：①将E. coli DH5α在LB平板上划线培养过夜。

第22卷第1期北华大学学报(自然科学版)Vol.22No.12021年1月JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(Natural Science)Jan.2021文章编号:1009-4822(2021)01-0042-05DOI :10.11713/j.issn.1009-4822.2021.01.008类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性刘㊀宁,崔梅英,王明月,杨泽斌,王㊀浩,毛㊀禹,方楷漪,夏㊀薇,关新刚(北华大学医学技术学院,吉林吉林㊀132013)摘要:目的㊀构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry 融合蛋白,探讨ELP-mCherry 融合蛋白与细胞的相容性.方法㊀对利用限制性内切酶Xba I 和Xho I 对mCherry 质粒和pET28a-ELP 载体同时进行双酶切,将酶切产物回收㊁连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建重组质粒pET28a-ELP-mCherry;将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,诱导表达ELP-mCherry 融合蛋白;利用可逆转变循环(ITC)法对ELP-mCherry 融合蛋白进行纯化;通过MTT 法探讨ELP-mCherry 融合蛋白与人胚肾上皮细胞HEK293T 和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞相容性.结果㊀DNA 测序结果显示成功构建了ELP-mCherry 原核表达载体;利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统成功表达ELP-mCherry 融合蛋白,通过ITC 法纯化得到了高纯度融合蛋白.MTT 结果表明:在所有ELP-mCherry 蛋白测试浓度下,HEK293T 和NIH3T3细胞存活率接近或超过100%.结论㊀成功构建ELP-mCherry 原核表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的ELP-mCherry 融合蛋白,ELP-mCherry 融合蛋白在HEK293T 和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性.关键词:类弹性蛋白多肽;红色荧光蛋白;原核表达;蛋白纯化;细胞相容性中图分类号:Q943.2文献标志码:A收稿日期:2020-03-08基金项目:吉林省科技发展计划项目(20180101213JC);吉林省人才开发资金项目(201858);吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20200033KJ);吉林省卫生计生青年科技骨干培养计划项目(2017Q040);吉林市科技创新发展计划项目(201831729);北华大学青年科研创新团队项目.作者简介:刘㊀宁(1996 ),女,硕士研究生,主要从事检验诊断新技术研究,E-mail:842832918@;通信作者:夏㊀薇(1964 ),女,博士,教授,硕士生导师,主要从事检验诊断新技术研究,E-mail:xiawei4016@.Prokaryotic Expression ,Purification and Cell Compatibility ofELP-mCherry Fusion ProteinLIU Ning,CUI Meiying,WANG Mingyue,YANG Zebin,WANG Hao,MAO Yu,FANG Kaiyi,XIA Wei,GUAN Xingang(School of Medical Technology ,Beihua University ,Jilin 132013,China )Abstract :Objective To construct elastin-like protein (ELP)prokaryotic expression vector with red fluorescent protein (mCherry)tag,to purify the ELP-mCherry fusion protein and investigate the biocompatibility of ELP-mCherry protein on cells.Method mCherry plasmids and pET28a-ELP plasmids were double digested by restriction endonucleases Xba I and Xho I,which were used to construct pET28a-ELP-mCherry plasmid.The recombinant plasmids were transformed into BL21(DE3)E.coli competent cells to express ELP-mCherry fusion protein.ELP-mCherry fusion was purified by reversible transformation cycle method (ITC).The biocompatibility of ELP-mCherry protein was evaluated on human renal epithelial cells and mouse embryonic fibroblasts by MTT method.Results DNA sequencing result indicated the successful construction of ELP-mCherry plasmid,and ELP-mCherry fusion protein was acquired and purified by using BL21(DE3)E.coli system via ITC method.MTT results showed that HEK293T and NIH3T3treated with ELP-mCherry fusion protein under all tested concentration has a cell viability of100%or more.Conclusion We successfully constructed ELP-mCherry prokaryotic expression vector,and got the high purity ELP-mCherry fusion protein,ELP-mCherry protein had good cell compatibility on HEK293T and NIH3T3.Key words:elastin-like polypeptide;mCherry;prokaryotic expression;protein purification;cell compatibility㊀㊀类弹性蛋白样多肽(elastin-like polypeptide, ELP)是一种由基因工程设计合成的非免疫原性且无热原性的具有良好生物相容性的蛋白质聚合物[1-2],ELP主要是由五肽重复序列单元构成,即Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG),其中Xaa是除脯氨酸以外的任一种氨基酸[3-5].ELP具有可逆相变循环(Inverse transitioncycling,ITC)的特性,即温度低于其相变温度,ELP多肽以高度可溶的形式存在于水溶液中;若温度高于其相变温度,ELP开始聚集,形成不溶物聚集体,且该过程可逆[6].由于ELP具有的这种特殊性质,在大肠杆菌中高产量表达的ELP蛋白可以利用可逆相变的特性进行快速纯化[7].红色荧光蛋白(mCherry)是SHANER 等[8]将发色基团mRFP进行位点突变得到的一种单体红色荧光蛋白[9],mCherry的荧光强度高且稳定性好[10].KALIMUTHU等[11]将含有mCherry基因的慢病毒颗粒转染人间充质干细胞,表达红色荧光mCherry基因,用生物发光成像法追踪间充质干细胞在荷瘤小鼠中的迁移.在本研究中,基于ELP蛋白的独特优势及mCherry的荧光成像特性,我们构建了ELP-mCherry原核表达载体,表达纯化了ELP-mCherry 融合蛋白,探讨了其与人肾上皮细胞HEK293T和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞的相容性,为设计开发新型的荧光示踪组织工程材料奠定了基础. 1㊀材料与方法1.1㊀细胞、主要仪器和试剂pET28a-ELP和pEGFP-N1-mCherry质粒(Origene 公司,美国);限制性内切酶Xba I与Xho I(生工生物工程(上海)有限公司);大肠杆菌BL21菌株为本实验室保存菌株;HEK293T细胞㊁NIH3T3细胞复苏自本实验室冻存细胞;胰蛋白胨㊁酵母提取物㊁卡那霉素㊁异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(生工生物工程(上海)有限公司);多功能酶标仪Tecan Spark(上海帝肯公司);PCR仪㊁核酸电泳以及SDS-PAGE电泳所使用的电泳仪与电泳槽(Bio-Rad公司,美国).1.2㊀ELP-mCherry原核表达载体的构建及鉴定根据GenBank中mCherry基因的核苷酸序列设计包含mCherry基因编码框的引物(生工生物工程(上海)有限公司),并在引物两端分别添加Xba I和Xho I酶切位点.以pEGFP-N1-mCherry为模板通过PCR扩增获得mCherry片段,凝胶回收mCherry片段.mCherry片段和pET28a-ELP质粒分别用1μL限制性内切酶Xba I和Xho I酶切,回收目的片段,利用T4DNA连接酶在4ħ连接过夜,将连接产物转化到DH5α感受态细胞,接种于含有卡那霉素的LB平板上过夜培养.从平板培养基中挑取单个菌落,170r/min摇床过夜,提取质粒后用Xba I限制性内切酶进行单酶切验证,再用Xba I和Xho I进行双酶切及1%琼脂糖凝胶电泳检测(Bio-rad),并将构建的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析.1.3㊀ELP-mCherry融合蛋白的原核表达将构建的pET28a-ELP-mCherry质粒转化到大肠杆菌感受态细胞(BL21)中,过夜培养后挑取单克隆菌落,接种于20mL含有卡那霉素的LB培养基中,37ħ㊁170r/min摇菌过夜;第2天按1ʒ50接种于1L含有卡那霉素的LB培养基中,当OD600达到0.6时,加入IPTG(终浓度1mmol/L),37ħ条件下培养6h诱导蛋白表达;离心收集菌体,PBS重悬菌体沉淀后加入苯甲基磺酰氟(PMSF,终浓度1mol/L),应用超声破碎菌体,离心收集上清和沉淀,通过SDS-PAGE电泳分析蛋白的表达情况. 1.4㊀ELP-mCherry融合蛋白的纯化利用ITC法快速纯化ELP-mCherry融合蛋白,将裂解液上清用NaOH调节pH至9.0,4ħ振荡过夜;第2天将裂解液上清在4ħ下,5000r/min离心90min,去除不溶性蛋白沉淀;将分离的上清恢复至室温后,置于37ħ摇床,250r/min震荡3h,在3h 内分3次加入NaCl至终浓度为1mol/L,37ħ离心收集沉淀,PBS重悬沉淀.以上过程重复两个循环,通过SDS-PAGE电泳分析蛋白的纯化情况.1.5㊀ELP-mCherry融合蛋白的细胞相容性用MTT法检测ELP-mCherry融合蛋白对HEK293T细胞和NIH3T3细胞增殖能力的影响.将对数生长期的HEK293T细胞和NIH3T3细胞以5000个/孔接种于96孔板中,置入37ħ㊁5%CO2培养箱中培养24h;第2天每孔中加入终浓度25㊁34第1期刘㊀宁,等:类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性50㊁100㊁200㊁300μg /mL 的ELP-mCherry 融合蛋白,每个ELP-mCherry 融合蛋白浓度做5个平行孔.培养48h 后每孔加入20μL 的MTT,37ħ孵育4h 后,每孔再加入150μL 二甲基亚砜(DMSO),沉淀充分溶解后在酶标仪(TECAN M200)上测定OD 490时每孔的吸光度值.2㊀结㊀㊀果2.1㊀ELP-mCherry 原核表达载体的构建将从mCherry 质粒中获得的PCR 产物与pET28a-ELP 质粒分别用限制性内切酶Xba I 和Xho I 双酶切后,酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶分离,将目的片段凝胶回收后连接,连接产物转化到Kana 平板,获得阳性克隆.提取质粒通过酶切进行验证,双酶切产生的片段与预期大小一致,提示pET28a-ELP-mCherry 重组质粒初步构建成功.见图1.DNA 测序结果显示mCherry 基因被成功插入表达载体中,没有发生碱基突变和移位,表明pET28a-ELP-mCherry 重组质粒构建成功.见图2.M.DL 5000DNA marker;1.Xba I 单酶切结果;2.Xba I 和Xho I 双酶切结果.图1pET28a-ELP-mCherry 重组质粒的酶切鉴定Fig.1Identification of pET28a-ELP-mCherry㊀㊀recombinant plasmid by enzymedigestion图2pET28a-ELP-mCherry 重组质粒的测序结果Fig.2Sequencing result of pET28a-ELP-mCherry recombinant plasmid2.2㊀ELP-mCherry 融合蛋白的原核表达将pET28a-ELP-mCherry 表达载体转入大肠杆菌感受态细胞(BL21)中,诱导ELP-mCherry 重组蛋白表达,SDS-PAGE 电泳结果显示:在细胞裂解液的上清在分子量30kDa 左右出现明显的蛋白条带,与ELP-mCherry 融合蛋白的预计分子量相符,说明ELP-mCherry 融合蛋白存在于细胞裂解液上清中,然后再利用ITC 法进行快速纯化.见图3.M.蛋白分子量标准;1.菌体细胞裂解液上清;2.菌体细胞裂解液沉淀.图3ELP-mCherry 重组蛋白的原核表达Fig.3Prokaryotic expression of ELP-mCherryrecombinant protein2.3㊀ELP-mCherry 融合蛋白的纯化利用ITC 法纯化ELP-mCherry 融合蛋白,裂解液上清通过两轮ITC 循环的结果显示:电泳条带纯化后的ELP-mCherry 融合蛋白在30kDa 位置显示单一条带,未出现明显的蛋白杂带,且蛋白分子量与ELP-mCherry 融合蛋白相符.因此,可以确定纯化蛋白为ELP-mCherry 蛋白.见图4.M.蛋白分子量标准;1.纯化后的ELP-mCherry 融合蛋白.图4ELP-mCherry 融合蛋白纯化Fig.4Purification of ELP-mCherry fusion protein2.4㊀ELP-mCherry 融合蛋白细胞相容性分析将不同浓度ELP-mCherry 融合蛋白(25㊁50㊁100㊁200㊁300μg /mL)分别处理HEK293T 细胞及NIH3T3细胞48h 后,通过MTT 法检测细胞的存活率.处理48h 后,HEK293T 细胞的存活率在各个浓44北华大学学报(自然科学版)第22卷度下都超过100%,NIH3T3细胞在测试所有浓度下也接近100%,这些结果说明ELP-mCherry 融合蛋白在两种细胞中都具有良好的细胞相容性.见图5.图5ELP-mCherry 融合蛋白的细胞相容性Fig.5Cell compatibility of ELP-mCherry fusion protein3㊀结㊀㊀论利用传统亲和层析法(麦芽糖结合蛋白MBP㊁谷胱甘肽S-转移酶GST㊁多聚组氨酸标签His㊁多聚精氨酸Arg)可以快速获得高纯度的目的蛋白,然而纯化介质成本较高,因此,迫切需要开发一种成本低廉的高纯度蛋白量产方法[12-13].1999年,MEYER 等[14]首次将ELP 与其他蛋白融合表达时发现了其可逆温度相变转换的特性,从此开创了一种新的蛋白纯化方法,称为 ELP 化 ,即将目的蛋白基因与ELP 基因的N 末端或C 末端融合而获得融合蛋白的方法.由于类弹性蛋白多肽类衍生蛋白具有可逆温度相变(低温溶解,高温聚集)特性,应用ITC 法对ELPs 蛋白进行纯化只需要加盐㊁升温(蛋白聚集)㊁离心(收集蛋白沉淀)㊁蛋白复溶几个步骤即可完成,多数情况下只需要2~3轮ITC 纯化即可获得高纯度的目的蛋白,无需昂贵的亲和层析介质,极大地降低了蛋白的生产成本,有利于进行大规模的蛋白质生产.近年来 ELP 化 法在重组蛋白纯化㊁改善目的蛋白半衰期㊁提升蛋白产量㊁作为蛋白的递送载体等方面获得了广泛应用[15-18].例如,MOKTAN 等[19]将细胞穿膜肽和促凋亡肽分别融合在ELP 基因的N 末端和C 末端,通过大肠杆菌表达系统制备了一种新型的蛋白抗肿瘤药物SynB1-ELP-KLAK,结果显示融合蛋白具有显著抑制肿瘤细胞增殖的能力.PHAN 等[20]将两种禽流感H 5N 1抗原与ELP 融合后在转基因烟草中进行融合蛋白表达,并利用ITC 方法成功获得了融合蛋白,结果显示ELP 化方法在烟草表达系统中能够显著提高目的蛋白产量.FLOSS 等[21]将anti-HIV-1单克隆抗体2F5与ELP 融合后在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)也获得了成功表达,结果显示单克隆抗体与ELP 融合并未影响2F5与抗原的结合活性,显示ELP 化法在哺乳动物表达系统中的有效性.本研究结果显示:通过构建ELP-mCherry 融合蛋白的表达载体,并将其转入大肠杆菌中进行融合蛋白表达,应用ITC 法对融合蛋白进行纯化,得到纯度较高的ELP-mCherry 融合蛋白.鉴于ELP 蛋白在细胞中极佳的细胞相容性,我们随后检测了ELP-mCherry 融合蛋白在HEK293T 细胞和NIH3T3细胞中的细胞相容性,结果显示融合蛋白在两种细胞的存活率超过或接近100%,提示引入mCherry 并未降低ELP 的细胞相容性,为接下来的组织工程应用奠定了良好的材料基础.mCherry 红色荧光蛋白的最大激发波长为587nm [22-24],具有结构稳定㊁表达量高㊁测定简便等优点,因此,被广泛用来对组织细胞定位进行示踪.将ELP 与mCherry 制备成ELP-mCherry 融合蛋白,既可以利用ELP 的可逆温度相变转换特性纯化的融合蛋白,又可以利用mCherry 高度稳定的红色荧光追踪其分布[25],因此,可作为理想的集示踪与支架功能于一身的生物材料用于皮肤损伤愈合㊁组织修复等工程应用.综上所述,本研究成功构建pET28a-ELP-mCherry 表达载体,表达并纯化ELP-mCherry 融合蛋白,ELP-mCherry 融合蛋白对HEK293T 细胞和NIH3T3细胞具有良好的细胞相容性,此研究为开发新型的组织工程示踪材料奠定了基础.参考文献:[1]MECO E,LAMPE K J.Impact of elastin-like proteintemperature transition on PEG-ELP hybrid hydrogel pro-perties[J].Biomacromolecules,2019,20(5):1914-1925.[2]MULLERPATAN A,CHANDRA D,KANE E,et al.Purification of proteins using peptide-ELP based affinityprecipitation[J].Biotechnol,2020,309:9-67.[3]GONZALEZ V J,GIROTTI A,MUNOZ R,et al.Self-54第1期刘㊀宁,等:类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性assembling ELR-based nanoparticles as smart drug-delivery systems modulating cellular growth via Akt[J].Bioma-cromolecules,2019,20(5):1996-2007.[4]TA D T,VANELLA R,NASH M A.Bioorthogonal elastin-like polypeptide scaffolds for immunoassay 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胸腺肽αl原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达崔雪志;马凤龙;乔彦良;刘焕奇;任庆娜;刘焕珍【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2008(24)7【摘要】构建胸腺肽αl(Thymosinαl,Tαl)基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,为大量获得胸腺肽αl打下基础。

将人工合成的Tαl三串体基因插入到表达载体pET32a后,CaC12法转化大肠杆菌BL21,经氨苄青霉素筛选后用IPTG 诱导表达,SDS-PAGE检测BL21中胸腺肽αl的表达。

大肠杆菌中检测到与目的蛋白相对分子量(31kD)相符的条带。

成功构建了Tαl原核表达载体,该蛋白能在大肠杆菌中表达。

【总页数】4页(P22-25)【关键词】胸腺肽αl;表达载体pET32a;SDS—PAGE【作者】崔雪志;马凤龙;乔彦良;刘焕奇;任庆娜;刘焕珍【作者单位】青岛农业大学动物科技学院;山东信得科技股份有限公司【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定 [J], 邵敏;王新颖;刘星;王燕;周鹤峰;葛正龙2.蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化 [J],乔鑫;王妍;李俊杰;段翠密;王海滨;周瑾;杜芝燕;王常勇;3.蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化 [J], 乔鑫;王妍;李俊杰;段翠密;王海滨;周瑾;杜芝燕;王常勇4.铜绿假单胞菌外膜蛋白Opr Ⅰ原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 刘潇;李文桂;罗广旭5.中介蝮蛇毒纤溶酶基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 刘玉芬;于德涵;刘鹏;陈辉;赵文阁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。