PADRE-TGFβ1融合蛋白的原核表达及鉴定

中文摘要目的：对融合蛋白d-EGF二级、三级结构进行预测并分析其活性部位的可能影响，进行原核表达，并对表达产物进行分析鉴定。

方法：以融合蛋白质基因序列为基础，用DNAStar软件预测其蛋白质的二级结构；用Insight II软件对其三级结构进行建模预测。

在对融合蛋白理论预测的基础上，分别构建含β-defensin-3、EGF的重组质粒，应用重组PCR等方法，将EGF的基因序列融合到β-defensin-3 DNA序列的3’末端，将融合基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建目的重组质粒pET-SUMO-d-EGF。

采用PCR、测序等方法对目的基因是否正确重组进行鉴定；以重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3），以IPTG 诱导表达目的蛋白质，表达产物经过Ni-trap柱纯化，SDS-PAGE检测表达初产物及纯化产物。

最后用Western-blot对其特异性进行鉴定；用MTT法检测其促细胞增殖活性；用纸片扩散法药物敏感试验、微量稀释法检测其抗菌活性。

结果：采用DNAStar 软件的Gamier Robson 方法预测的结果表明，融合蛋白质d-EGF含较多的β折叠结构；Charge Density-Charge法预测蛋白质3-22、31-48区段带丰富的正电荷；Insight II软件分析显示重组蛋白d-EGF中原蛋白β-defensin-3、EGF三级结构中的活性必须的六个链内二硫键在融合蛋白中都能够正确形成，维持β-defensin-3三级结构的3个反向平行的β折叠片结构在融合蛋白中能够形成。

融合蛋白的结构含有原蛋白β-defensin-3、EGF的生物活性结构。

成功构建β-defensin-3、EGF 重组质粒，经重组PCR成功扩增出294bp的目的片段，重组体PCR结果与预期结果一致，测序正确。

转入重组质粒的E.coli BL21（DE3）经IPTG诱导、SDS-PAGE 分析得到28 kD左右的目的蛋白条带。

转化生长因子-β1(TGF-β1)与肺纤维化研究的进展陈刚;余民浙【摘要】转化生长因子-β1（Transformating Growth Factorbetal，TGF-β1）是一种多功能的细胞因子，是由2条分子量为11Kd有112个氨基酸构成的单链通过二硫键结合而成的分子量为25Kd的多肽。

它在细胞的生长、分化、免疫调节、调节细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）合成及损伤后的修复方面发挥着重要的作用。

在哺乳动物中。

TGF—β家族有3个亚型TGF—β1、TGF-β2、TGF—β3，它们通过与相应的受体结合而发挥生物作用。

活化的TGF—β过度表达对肺、【期刊名称】《中国疗养医学》【年(卷),期】2007(016)001【总页数】3页(P3-5)【关键词】转化生长因子-β1;TGF-β2;肺纤维化;细胞因子;免疫调节;细胞外基质;哺乳动物【作者】陈刚;余民浙【作者单位】066104,国家煤矿安全监察局尘肺病康复中心;066000,秦皇岛市海港医院【正文语种】中文【中图分类】R5转化生长因子－β1（Transformating Growth Factor beta1,TGF-β1）是一种多功能的细胞因子，是由 2条分子量为 11Kd有 112个氨基酸构成的单链通过二硫键结合而成的分子量为 25Kd的多肽。

它在细胞的生长、分化、免疫调节、调节细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）合成及损伤后的修复方面发挥着重要的作用[1，2]。

在哺乳动物中，TGF-β 家族有3个亚型TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它们通过与相应的受体结合而发挥生物作用。

活化的 TGF-β 过度表达对肺、肝、肾等组织病理改变的影响非常显著，特别是致纤维化方面。

在体内试验中，TGF-β1对纤维化的作用明确、TGF-β2作用不明确、TGF-β3无作用；然而体外试验发现 TGF-β 的 3个亚型都有促进纤维化的作用。

5犬瘟热病毒融合蛋白的真核细胞表达及鉴定白桂杰1,2,张同存1,校海霞2*(1.天津科技大学生物工程学院300457;2.中国科学院天津工业生物技术研究所300308)摘要:目的:通过293T 真核细胞表达犬瘟热病毒融合蛋白,并鉴定其抗原性。

方法:利用PCR 方法扩增犬瘟热病毒(Onderstepoort 株)的融合蛋白胞外段,在C 末端引入氨基酸突变和His 标签,插入pFuse 载体,构建重组质粒pFuse-CDV-sF-ecto 。

将重组质粒转染293T 细胞,72~96h 后收上清,通过镍离子亲和层析和凝胶层析纯化目的蛋白,利用酶联免疫吸附试验(ELISA )鉴定sF-ecto 蛋白抗原性。

结果:细胞上清先经His-Trap TM 富集,而后用Superdex 20010/300GL 纯化,出峰体积为8.43mL ,由出峰位置判断表达的CDV-sF-ecto 蛋白为多聚体。

ELISA 检测发现CDV-sF-ecto 与商业化犬瘟热病毒单克隆抗体有较高反应值。

本研究成功表达了犬瘟热病毒融合蛋白的胞外段,并证明该蛋白对犬瘟热病毒特异性单克隆抗体有较高的结合活性。

关键词:犬瘟热病毒;融合蛋白;抗原性;表达;ELISA 犬瘟热病毒(CDV )是引发犬瘟热疾病的高致病性病原体,CDV 的感染性较强,致病率较高。

主要的自然宿主包括犬科动物、熊猫科动物和灵长目动物等。

CDV 会通过呼吸系统、消化系统、泌尿系统和神经中枢系统进行传播,可使动物出现卡他性炎症或者神经性症状等[1]。

目前发现的CDV 基因型有17种[2],亚洲地区主要流行Asia 型,在我国流行的CDV 基因型主要为Asia 1型和Asia 2型[3-4]。

近些年来,犬瘟热疾病的发病趋势逐年递增,这给我国的毛皮动物养殖场和饲养宠物数量比较多的城市带来了巨大经济损失。

CDV 属于副黏病毒科(Paramyxoviridae )麻疹病毒属(Mor ⁃billivirus ),是无节段的负链单股RNA 病毒,该病毒的基因组呈线状分布[5-7],主要编码六种结构蛋白[8-10],其中融合蛋白(F )对于CDV 在侵入宿主细胞的过程中具有重要意义。

待测蛋白与gfp蛋白的融合表达待测蛋白与GFP蛋白的融合表达是一项常用的实验技术，可以用来研究蛋白的亚细胞定位、功能性研究以及蛋白的相互作用等。

在本文中，我将以一步一步的方式解释待测蛋白与GFP蛋白的融合表达的过程和原理。

第一步：选择适合的表达载体在进行待测蛋白与GFP蛋白的融合表达之前，首先需要选择合适的表达载体。

常见的表达载体包括质粒和病毒载体。

质粒通常用于体内表达，病毒载体则可以用于体内或体外表达。

选择表达载体时，需要考虑载体的大小、复制起源、选择标记等因素。

在此过程中，一个常用的表达载体是pEGFP-C1，它兼具了高效的GFP蛋白表达和稳定性。

第二步：将待测蛋白与GFP基因连接在将待测蛋白与GFP蛋白融合表达之前，需要将待测蛋白基因与GFP基因连接。

连接的方法有多种，常见的方法包括PCR扩增和限制性内切酶消化连接。

PCR扩增可以利用引物特异性扩增待测蛋白基因和GFP基因的DNA片段，然后通过连接酶将两个PCR产物连接在一起。

限制性内切酶消化连接则需要选择适合的限制性内切酶将待测蛋白基因和GFP基因进行消化，然后通过DNA连接酶将两个消化片段连接在一起。

第三步：转染细胞或注射在融合表达载体构建完成后，下一步是将表达载体导入到细胞中。

有两种常见的方法可以实现这一步骤：细胞转染和动物体内注射。

细胞转染可以通过化学法、电穿孔法或基因枪等技术将表达载体导入到细胞中。

动物体内注射则可以将表达载体注射到实验动物体内，使表达载体进入目标组织或器官。

第四步：蛋白表达检测一旦表达载体成功转染或注射到细胞或动物体内，下一步是检测蛋白的表达情况。

常见的方法包括免疫荧光染色、免疫组织化学、Western blot 等。

免疫荧光染色可以使用抗GFP抗体或待测蛋白特异性抗体与GFP融合蛋白结合，并通过荧光显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位。

免疫组织化学可以利用特异性抗体与融合蛋白结合，并使用组织化学染色技术观察蛋白的分布情况。

·６０·纤维连接蛋白１的原核表达、纯化及抗体的制备王菲菲苏畅吴海东王萌孔鹏洲刘民李欣汤华【摘要】目的构建人纤维连接蛋白ｌ（ＦＮｌ）基因的原核表达载体，诱导其表达并纯化该蛋白，制备特异性抗体。

方法利用ＲＴ—ＰＣＲ方法扩增人ＦＮＩ编码序列４５０ｂｐ的片段，包含ＦＮｌ羧基端的１５０个氨基酸。

构建原核表达质粒ｐＲＳＥＴＡ２－ＦＮｌ，转化大肠杆菌Ｂ也１（ＤＥ３），ＦＮｌ蛋白经异丙基二Ｂ－Ｄ·硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达。

融合蛋白通过Ｎｉ“一ＮＴＡ树脂亲和纯化后免疫兔制备抗体血清。

蛋白质免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和免疫组化检测其特异性。

结果成功构建重组质粒ｐＲＳＥＴＡ２一ＦＮＩ，限制性内切酶酶切鉴定及ＤＮＡ测序均显示插入片段正确。

ＳＤＳ．ＰＡＧＥ凝胶显示表达的融合蛋白相对分子质量约为２００００（ＦＮＩ．Ｈｉｓ标签），与预期结果一致。

酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测抗体效价约为ｌ：１００００，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示可以特异性地检测出人血浆和肝癌细胞系ＨｅｐＧ２全细胞裂解液中相对分子质量约２５００００的纤维连接蛋白。

免疫组织化学可显示ＦＮＩ在正常肺及肺癌组织中的特异性分布。

结论成功地原核表达了ＦＮＩｃ．末端蛋白，并免疫获得了抗ＦＮＩ特异性抗体。

【关键词】纤维连接蛋白；基因表达；抗体；癌症Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ１ＷＡＮＧＦｅｉ－ｆｅｉ，ＳＵＣｈａｎｇ，ＷＵＨａｉ－ｄｏｎｇ，ＷＡＮＧＭｅｎｇ，ＫＯＮＧＰｅｎｇ·ｚｈｏｕ，ｕｕＭｉｎ。

ＬＩＸｉｎ，ＴＡＮＧＨｕａ．Ｔｉａｎｊｉｎ啦ＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒａｎｄＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＴａｎｇＨｕａ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｔａｎ９２００２＠ｙａｈｏｏ．ＣＯｒｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｒｅｓｓｈｕｍａｎｆｉｂｍｎｅｃｔｉｎｌａｎｄｇｅｎｅｒａｔｅｓｐｅｃｉｌｉｃｈｕｍａｎｆｉｂｍｎｅｃｔｉｎｌａｎｔｉ：ｂｏｄｙｉｎｒａｂｂｉｔ．ＭｅｔｈｏｄｓＡ４５０ｂｐｌｅｎｇｔｈｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＦＮｌｇｅｎｅ。

重组结核杆菌融合蛋白的使用方法一、引言重组蛋白技术是现代生物技术领域的重要研究方向之一。

其中，重组结核杆菌融合蛋白作为一种新型的免疫原，具有广泛的应用前景。

本文旨在介绍重组结核杆菌融合蛋白的制备方法以及其在临床和实验室中的应用。

二、制备重组结核杆菌融合蛋白1. 基因克隆首先，需要将目标基因克隆到表达载体中。

常用的表达载体有pET等。

将目标基因PCR扩增后与表达载体进行连接，并经过酶切和连接等步骤构建成完整的表达载体。

2. 转染细胞将构建好的表达载体转染到宿主细胞（如大肠杆菌）中，使其能够产生目标蛋白。

3. 蛋白纯化通过离心、超滤等步骤，将含有目标蛋白的细胞裂解液进行初步分离。

接下来，可采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对目标蛋白进行纯化。

4. 鉴定通过SDS-PAGE、Western blot等方法对目标蛋白进行鉴定，确保其纯度和活性。

三、重组结核杆菌融合蛋白的应用1. 临床应用重组结核杆菌融合蛋白可作为一种新型的免疫原，用于结核病的诊断和预防。

例如，在结核病的血清学检测中，可采用重组结核杆菌抗原作为诊断试剂。

此外，重组结核杆菌抗原还可用于疫苗开发。

2. 实验室应用在实验室中，重组结核杆菌抗原可作为一种重要的实验工具。

例如，在免疫学研究中，可采用重组结核杆菌抗原来激活T细胞，并进一步探究T细胞的功能。

此外，在药物筛选方面，还可以利用重组结核杆菌抗原来筛选可能的药物靶点。

四、使用注意事项1. 在制备过程中，应注意操作规范，避免交叉污染。

2. 在使用前应对制备的重组结核杆菌融合蛋白进行鉴定，确保其纯度和活性。

3. 在应用过程中，应注意实验条件的控制，避免影响结果的准确性。

五、总结重组结核杆菌融合蛋白是一种新型的免疫原，在临床和实验室中具有广泛的应用前景。

通过基因克隆、转染细胞、蛋白纯化等步骤，可以制备出高纯度的重组结核杆菌抗原。

在使用过程中，应注意操作规范和实验条件控制，以保证结果的准确性。

融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化戚华兵;汪仕良;王凤君【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)22【摘要】目的构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1αPAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。

方法分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。

结果成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG 诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。

结论含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础。

【总页数】3页(P2213-2215)【关键词】原核表达系统;TAT蛋白转导结构域;缺氧诱导因子1α;PAS—B结构域【作者】戚华兵;汪仕良;王凤君【作者单位】第三军医大学西南医院全军烧伤研究所【正文语种】中文【中图分类】Q503;Q51【相关文献】1.抗凋亡融合蛋白 PTD－Bcl－xL 原核表达载体的构建及表达纯化 [J], 王晓晔;石博妹;王英群;李珣;刘徳玉;李铭;李芳芳;胡传活2.β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化 [J], 朱爱华;李敬;陆军;钱进;郑元林3.PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化 [J], 杜琴;蔡嘉镜;蒋春萍;徐磊;张国元;王东生4.HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定 [J], 邱会平;程晓东;卢春5.含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定 [J], 葛高霞;王平;卢春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

上皮性卵巢癌组织中 TGF-β1、FOXQ1、VEGF、E-cad、N-cad 的表达及意义李红雨;余亚南;胡晓静;刘琰;刘星烁;张敏【摘要】目的：观察转化生长因子β1（TGF-β1）、叉头框蛋白 Q1（FoxQ1）、E-钙黏蛋白（E-cad）和 N-钙黏蛋白（N-cad）、血管内皮生长因子（VEGF）在上皮性卵巢癌卵巢上皮组织中的表达，并探讨其意义。

方法上皮性卵巢癌40例（恶性组）、良性上皮性卵巢肿瘤39例（良性组）、正常卵巢38例（正常组），手术切取卵巢上皮组织，采用实时荧光定量 PCR 和免疫组织化学法分别检测各组卵巢上皮组织中 TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF 的 mRNA和蛋白表达。

采用 Spearman 相关分析法分析上述各指标之间的相关性。

结果恶性组 TGF-β1、FOXQ1、N-cad、VEGF mRNA、蛋白表达高于正常组和良性组，E-cadmRNA、蛋白表达低于正常组、良性组（P 均＜0．05）。

上皮性卵巢癌中TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF 表达与FIGO 分期、淋巴结转移有关。

上皮性卵巢癌中 TGF-β1与FOXQ1、E-cad、N-cad 呈正相关（r 分别为0．335、0．123、0．411，P 分别为0．003、0．002、0．000）；FOXQ1与 E-cad 呈正相关（r ＝0．321，P ＝0．000）；E-cad 与 N-cad、VEGF 呈正相关（r 分别为0．433、0．283，P 分别为0．000、0．010）。

结论上皮性卵巢癌卵巢上皮组织中 TGF-β1、FOXQ1、VEGF、N-cad 表达升高，E-cad 表达降低，共同参与上皮性卵巢癌的发生发展、侵袭及转移。

【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2017(057)002【总页数】4页(P91-93,94)【关键词】卵巢肿瘤;上皮性卵巢癌;上皮细胞间质转化;E-钙黏蛋白;N-钙黏蛋白;转化生长因子β1;叉头框蛋白Q1;血管内皮生长因子【作者】李红雨;余亚南;胡晓静;刘琰;刘星烁;张敏【作者单位】郑州大学第三附属医院，郑州 450052;郑州大学第三附属医院，郑州 450052;郑州大学第三附属医院，郑州 450052;郑州大学第三附属医院，郑州450052;郑州大学第三附属医院，郑州 450052;郑州大学第三附属医院，郑州450052【正文语种】中文【中图分类】R331卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一[1]，严重威胁女性生命健康。

融合蛋白TAT-RabGEF1原核表达载体的构建及蛋白表达方虹仪;郭娜;邢纪斌;罗晨芳【摘要】[目的]构建PET28a-TAT-RabGEF1重组质粒载体,在E.coli Rosetta(DE3)菌株中高效表达并纯化融合蛋白,研究TAT-RabGEF1融合蛋白对肥大细胞的跨膜转导活性.[方法]以小鼠组织cDNA为模板,设计上游和下游含有限制性酶切位点和TAT序列的引物,PCR扩增目的片段TAT-RabGEF1,并通过双酶切构建PET28a-TAT-Rab-GEF1重组质粒载体,在E.coli Rosetta(DE3)大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,产物用亲和层析柱纯化后测量浓度及鉴定.CCK-8检测融合蛋白的细胞毒性,并用荧光显微镜及荧光分光光度计定性定量观察其对小鼠肥大细胞瘤细胞P815的转导活性.[结果]成功构建了PET28a-TAT-RabGEF1重组载体,高效表达了具有较高特异性,相对分子质量约为57 ku的融合蛋白TAT-RabGEF1,0.1、1、10 μmol/L浓度的TAT-RabGEF1蛋白对细胞无明显毒性,荧光显微镜显示1 μmol/L浓度的融合蛋白TAT-RabGEF1具有快速转导进入P815细胞内的能力,且为进入细胞的饱和浓度.[结论]通过TAT-RabGEF1的原核表达和蛋白纯化分析,证实了TAT-PTD的跨膜转导活性,为研究RabGEF1在肥大细胞激活途径中的作用提供了物质基础.%[Objective]To construct recombinant expression vector PET28a-TAT-RabGEF1,express,purify fusion pr-otein effectively in E.coliRosetta(DE3),and investigate its transmembrane effect in vitro on P815 cells.[Methods]With cDNA in rats′tissues as the template,two primers containing the TAT sequence and two designed enzyme restriction cutting sites were designed. TAT-RabGEF1 fragment was amplified by PCR,and its product was inserted into PET-28a vector to construct recombinant plasmid PET28a-TAT-RabGEF1 prokaryotic expression vector. Therecombinant vector was trans-formed into E.coli Rosetta(DE3)and express fusion proteins.The protein products were purified by affinity chromatography. The efficiency of the transduction of fusion protein into P815 cells were detected by immunofluorescence and analyzed by fluo-rescence spectro-photometer,with using methods of CCK-8 to analyze the cells viability after transduction of different con-centrations of fusion protein.[Results]The recombinant vector PET28a-TAT-RabGEF1 was constructed and the fusion pro-tein TAT-RabGEF1 was successfully expressed in E.coli Rosetta(DE3). By western blotting and SDS-PAGE we can see that the protein products′ relative molecular mass was about 57 ku,which was consistent with the target one,TAT-Rab-GEF1.The immunofluorescence results suggested that the fusion protein had the ability to transduct into P815 cells,and sat-uration of fusion proteins to be transducted into cells was 1 μmol/L.[Conclusion]Constructed recombinant vector PET28a-TAT-RabGEF1 and expressed fusion protein,TAT-RabGEF1,which verified the TAT′s ability of transduction. And it would build a solid technical foundation for the following research on the effect of RabGEF1′s on the activation of mast cells.【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2018(039)001【总页数】7页(P61-67)【关键词】鸟嘌呤核苷酸交换因子1;TAT蛋白;融合蛋白;载体构建【作者】方虹仪;郭娜;邢纪斌;罗晨芳【作者单位】中山大学附属第三医院麻醉科,广东广州510630;中山大学附属第三医院麻醉科,广东广州510630;中山大学附属第三医院麻醉科,广东广州510630;中山大学附属第三医院麻醉科,广东广州510630【正文语种】中文【中图分类】R3鸟嘌呤核苷酸交换因子1（Rab5 GDP/GTP ex⁃change factor1，RabGEF1）是近年发现的一个Rab5的鸟苷酸交换因子，属小G蛋白家族。