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高效液相色谱法测定固体食品中的安赛蜜刁玉华，张加稳，陈娴（昆明市食品药品检验所，昆明 650032）摘要：建立一种高效液相色谱法测定固体食品中安赛蜜的方法。
以水为提取溶剂超声波提取安赛蜜，然后在提取液中加入沉淀剂除杂，采用C18反相色谱柱，紫外检测器，以0.02mol/L乙酸铵溶液∶甲醇=90∶10（v/v）为流动相，检测波长225nm，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量10μL进行检测，外标法定量。
安赛蜜出峰时间为4.348min，样品的检出限为0.57mg/kg，定量限1.89mg/kg，线性范围为0.5～50.0μg/mL，相关系数0.9998，安赛蜜的加标回收率在91.3%～99.3%之间，重复性实验的相对标准偏差在2% 以下（n=6）。
建立的前处理方法具有简单、快速、准确、实用性强的特点，可用于固体食品中安赛蜜的检测。
关键词：安赛蜜；高效液相色谱；固体食品中图分类号：TS207.3/TS202.1 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2021）03-0090-05 doi：10.19804/j.issn1006-2513.2021.03.015Determination of acesulfame K in solid food byhigh performance liquid chromatographyDIAO Yu-hua，ZHANG Jia-wen，CHEN Xian（Kunming Institute for Food and Drag Control，Kunming 650032）Abstract：A high performance liquid chromatography for determination of acesulfame K in solid food was developed. Acesulfame K was extracted using water，assisted by ultrasound，and purified by precipitation. Zinc acetate and potassium ferrocyanide was used for preparation. Acesulfame K was separated on a C18 column using 0.02mol/L ammonium acetate methanol（90∶10，v/v）as mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min and detected by ultraviolet detector at 225 nm. The column temperature was 30℃ and injection volume was 10μL. The quantitative detection was carried out by external standard. The retention time of acesulfame K was 4.348 min. The limit of detection was 0.57mg/ kg and limit of quantification was 1.89mg/kg. The linear range was between 0.5 and 50.0μg/mL with correlation coefficient of 0.9998. The mean spike recoveries for acesulfame K in a blank sample was between 91.3%and 99.3%，with a relative standard deviation below 2%（n=6） . The method was simple，rapid，accurate and practical. It can be used for determination of acesulfame K in solid food.Key words： acesulfame K；high performance liquid chromatography（HPLC）；solid food安赛蜜，学名乙酰磺胺酸钾（Acesulfame-K）是一种健康新型高强度甜味剂。
二、γ-氨基丁酸的高效液相色谱测定法本方法适用于保健食品中γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid）的测定。
本方法γ-氨基丁酸的检出限为10ng。
1.方法提要γ-氨基丁酸用异硫氰酸苯酯柱前衍生，衍生物采用氨基酸分析柱分离，二元流动相梯度洗脱，248nm波长下紫外检测器检测，以保留时间定性，以峰面积外标法定量。
2.仪器（1）高效液相色谱仪，配紫外检测器。
（2）旋涡混合器3.试剂本方法除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
（1）乙腈：色谱纯。
（2）异硫氰酸苯酯乙腈溶液：吸取0.5mL异硫氰酸苯酯，加入40mL乙腈溶解。
（3）盐酸溶液（0.1mol/L）：取分析纯浓盐酸8.3mL，加水稀释至1L。
（4）三乙胺-乙腈溶液：15mL三乙胺与85mL乙腈混合而成。
（5）γ-氨基丁酸标准品：纯度99.9%，Sigma公司。
（6）γ-氨基丁酸标准溶液：精确称取γ-氨基丁酸10mg，置于10mL容量瓶中，加0.1mol/L 盐酸溶液溶解并稀释到刻度，摇匀，得浓度为1mg/mL的标准储备溶液。
将此标准储备液用0.1mol/L盐酸溶液稀释成浓度分别为10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL的标准溶液系列。
（7）醋酸钠溶液：0.05mol/L，用作流动相A。
（8）乙腈-水溶液：乙腈-水（80+20），用作流动相B。
（9）正己烷。
4．测定步骤（1）供试样品溶液的制备1）提取：称取适量样品(相当于γ-氨基丁酸4mg，精密至0.001g)，置于100mL三角烧瓶中，加入盐酸溶液(0.1mol/L)适量，40℃超声提取20min，冷却，转移至100mL容量瓶，加盐酸溶液(0.1mol/L)至刻度，摇匀，静置，取适量过滤，得样品提取液。
2）衍生化：取样品提取液0.2mL，置于5mL具塞试管中，加异硫氰酸苯酯-乙腈溶液0.4mL，再加三乙胺-乙腈溶液1.4mL，摇匀，放置1小时，然后加入正己烷2mL，漩涡混合1min，静置，取下层液体作为待测溶液。
高效液相色谱检测葡萄及葡萄酒中7种有机酸方法的建立沈 燕1，张正文1，刘兴凯1，王福成2，邵学东1*（1.君顶酒庄有限公司，山东烟台 265607；2.烟台市蓬莱区葡萄与葡萄酒产业发展服务中心，山东烟台 265699）摘 要：目的：建立了利用高效液相色谱测定葡萄及葡萄酒中7种有机酸的检测方法。
方法：色谱条件为Hi-Plex H色谱柱（300 mm×7.7 mm，8 μm），PL Hi-Plex H保护柱（50 mm×7.7 mm，8 μm）；紫外检测波长210 nm；流动相为0.006 mol·L-1的硫酸；流速0.6 mL·min-1；柱温55 ℃；进样量10 μL。
结果：草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸出峰时间均在20 min以内；标准曲线线性关系良好，相关系数（R2）在0.999 9～1.000 0；检出限在0.031 4～0.722 3 mg·L-1；加标回收率在95.24%～102.04%，其相对标准偏差在0.16%～1.87%。
结论：该方法操作简单，检测时间短，具有较高的准确性和精确性。
关键词：有机酸；葡萄；葡萄酒；高效液相色谱；检测方法Establishment the Method of Seven Kinds of OrganicAcids in Grape and Wine by High Performance LiquidChromatographySHEN Yan1, ZHANG Zhengwen1, LIU Xingkai1, WANG Fucheng2, SHAO Xuedong1*(1.Junding Castle Co., Ltd., Yantai 265607, China; 2.Yantai Penglai District Grape and Wine Industry DevelopmentService Center, Yantai 265699, China)Abstract: Objective: To establish a HPLC method for the determination of 7 organic acids in grape and wine. Method: The chromatographic conditions were Hi-Plex H column (300 mm×7.7 mm, 8 μm) and PL Hi-Plex H protective column (50 mm×7.7 mm, 8 μm). UV detection wavelength 210 nm; sulfuric acid with 0.006 mol·L-1 mobile phase; flow rate 0.6 mL·min-1; column temperature 55 ℃. The sample size was 10 μL. Result: The peak time of oxalic acid, citric acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid, lactic acid and acetic acid were all within 20 min. The standard curve has a good linear relationship with the correlation coefficient（R2） ranging from 0.999 9 to 1.000 0. The detection limit was 0.031 4～0.722 3 mg·L-1. The recoveries ranged from 95.24% to 102.04%, and the relative standard deviations ranged from 0.16% to 1.87%. Conclusion: The method is simple to operate, short detection time, and has high accuracy and accuracy.Keywords: organic acid; grape; wine; high performance liquid chromatography; detection method有机酸是葡萄果实及葡萄酒中体现风味的主要物质之一，其含量是衡量葡萄果实成熟度和品质的重要参数，在葡萄酒的酿造中发挥着关键作用，对酒的感官质量有一定的影响，与酒的物理化学以及微生物稳定性有着紧密联系[1-4]。
固相萃取-高效液相色谱-串联质谱检测污水中14种全氟化合物史丽;王兴;杨艳;张泽;赵蔚【期刊名称】《化学研究与应用》【年(卷),期】2024(36)3【摘要】本文建立了一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(SPE-HPLC-MS/MS)同时测定水中全氟烷基羧酸(PFCAs)、全氟烷基磺酸(PFSAs)、全氟辛基磺酰胺(FOSAs)等14种全氟化合物及其前体物的分析方法,化合物通过多反应监测(MRM)模式检测,内标法定量。
比较了不同种类溶剂的流动相、固相萃取柱类型对化合物峰形、响应和提取净化效率的影响。
考察了方法的线性范围、检出限和测定下限、精密度及准确度。
结果表明,水中14种全氟化合物及前体物在0.5~50μg·L^(-1)范围内线性关系良好,相关系数r大于0.999;在低、中、高3个添加水平下平均加标回收率为74.2%~112%,相对标准偏差为1.0%~17.3%,方法检出限和测定下限分别为0.5~2.4 ng·L^(-1)和2.0~9.6 ng·L^(-1)。
应用本方法分析某污水厂进水、出水及中间工艺流程中的PFCs,发现均有不同程度的检出,检出率在71.4%~92.9%。
其中PFOA,PFBS,PFHxA和PFHxS浓度最高,为33.9~150 ng·L^(-1)。
本方法前处理简便、灵敏度高、重现性好,可同时检测水中多种全氟化合物及前体物,具有较好的实用性。
【总页数】8页(P647-654)【作者】史丽;王兴;杨艳;张泽;赵蔚【作者单位】北京市科学技术研究院资源环境研究所;工业场地污染与修复北京市重点实验室【正文语种】中文【中图分类】O657.7【相关文献】1.近岸及河口海水中全氟化合物的固相萃取富集/超高效液相色谱-串联质谱测定2.固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定地表水中16种全氟有机化合物3.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定污水中16种全氟和多氟烷基化合物4.饮用水中全氟辛酸和全氟辛烷磺酸的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定法5.固相支撑液液萃取-液相色谱-串联质谱检测全血、尿液中氟胺酮和去甲氟胺酮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高效液相标的曲r方要求与流程解析下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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三七化瘀口服液高效液相色谱指纹图谱的建立江国华;黄健;陈淑映【摘要】目的：探讨构建三七化瘀口服液指纹图谱的技术要点及检测条件，建立能反映该制剂整体特征的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱质量评价方法，为提高制剂质量稳定性和保证临床用药的安全有效提供依据。
方法色谱柱为Shim－pack VP－ODS柱（250 mm ×4.6 mm，5μm），流动相为（A）乙腈－（B）0.05%磷酸水( pH=5，梯度洗脱)，流速为1 mL/min，检测波长为203 nm，进样量为10μL。
结果10个不同批次样品的相似度均在0.9~1.0间。
结论该色谱图可作为三七化瘀口服液指纹图谱，用于三七化瘀口服液的质量评价。
%Objective To investigate the fingerprinting techniques and detection conditions of Sanqi Huayu Oral Liquid,build an HPLC fingerprint quality evaluation method to reflect the overall characteristics of the preparation in order to improve the quality of prepara-tion and stability,and provide basis for the safety and effectiveness of clinical medication. Methods The chromatographic column was Shim-packVP-ODS column(250 mm × 4. 6 mm,5 μm);mobile phase was(A)acetonitrile-(B)0. 05% phosphoric acid water(pH=5, gradient elution),the flow rate was 1 mL/min,the detection wavelength was 203 nm;the injection volume was 10 μL. Results By cal-culating the similarity,the similarity of the 10 batches of samples were between 0. 9-1. 0. Conclusion The chromatographic diagram can be used as the fingerprintof Sanqi Huayu Oral Liquid,and to evaluate its quality.【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2016(025)008【总页数】4页(P69-71,72)【关键词】三七化瘀口服液;指纹图谱;高效液相色谱法【作者】江国华;黄健;陈淑映【作者单位】广东省佛山市中医院，广东佛山 528200;广东省佛山市中医院，广东佛山 528200;广东省佛山市中医院，广东佛山 528200【正文语种】中文【中图分类】R284.1;R286.0三七化瘀口服液为我院中医骨伤科的优良验方，由三七和延胡索经醇提浓缩后调配分装而成，具有活血化瘀、消肿止痛、舒筋通经、强身健体的功效，经多年临床实践证明，对跌打损伤、各种血症、痛症等症疗效显著[1－2]。
高效液相标准曲线在高效液相色谱技术中，标准曲线是非常重要的一部分，它能够帮助我们准确地定量分析待测物质的浓度。
本文将介绍如何建立高效液相色谱的标准曲线，以及如何进行标准曲线的验证和应用。
首先，建立高效液相色谱的标准曲线需要准备一系列不同浓度的标准品溶液。
这些标准品溶液的浓度应该覆盖待测物质的浓度范围，并且需要有一定的间隔，以便能够得到较为均匀的标准曲线。
在准备标准品溶液时，需要确保每种溶液的浓度准确无误，可以通过称量、稀释等方法来保证。
接下来，将这些标准品溶液依次注入高效液相色谱仪中进行分析。
在分析过程中，需要记录下每种标准品溶液的峰面积或峰高，并且要进行多次重复实验以确保数据的准确性。
得到的数据将会构成标准曲线的数据点，我们可以利用这些数据点来进行曲线拟合，得到标准曲线的方程和相关系数。
在得到标准曲线之后，需要对其进行验证。
验证标准曲线的方法可以包括再现性实验、稳定性实验、加标回收率实验等。
通过这些验证实验，可以评估标准曲线的可靠性和稳定性，确保其可以准确地用于待测物质的定量分析。
最后，建立的标准曲线可以用于实际样品的浓度测定。
在进行样品浓度测定时，需要将待测样品的峰面积或峰高代入标准曲线的方程中，通过计算得到待测样品的浓度。
需要注意的是，在进行样品浓度测定之前，要先进行样品前处理，以确保样品中没有干扰物质影响测定结果的准确性。
总之，建立高效液相色谱的标准曲线是一项重要的工作，它直接影响到待测物质浓度的准确性。
通过合理准备标准品溶液、进行标准曲线的建立和验证，以及对样品的浓度测定，可以确保我们得到准确可靠的分析结果。
希望本文的介绍能够对您在高效液相色谱分析中的标准曲线建立有所帮助。
高效液相色谱仪操作步骤1.准备工作：a.检查设备是否正常运转，所有零件是否安装和连接正确。
b.检查每个必需的溶液和试剂是否充足并且符合规定的质量标准。
c.检查色谱柱是否装配完好，并根据要进行的分析校准适当的流量和压力范围。
d.打开色谱软件，并设置所需的分析方法和参数。
e.开始预热色谱柱直到达到所需的温度。
2.样品制备：a.准备待检测样品的溶液或提取物，并进行必要的预处理步骤，例如固相萃取、浓缩、稀释或离心等。
b.将样品溶液通过0.22微米滤膜过滤，以去除杂质、微粒和可能堵塞色谱柱的颗粒。
3.样品进样：a.打开进样器，并选择合适的样品进样模式（如定量进样或自动进样）。
b.使用微量注射器或自动进样器将样品注入进样器，并确定进样量符合分析方法的要求。
4.色谱柱选择：a.根据样品特性和分析目的选择合适的色谱柱类型（如反相、离子交换、大小排阻等），尺寸（长度和内径）和填充材料等。
b.根据样品的pH值调节移动相的酸碱度，以满足分析要求和保护色谱柱。
5.色谱条件设置：a.设置流量速率，根据色谱柱的额定最大流速和样品的分离要求来确定。
一般来说，较高的流速可提高分离速度，但也会降低分离效果。
b.设置柱温，并确保温度稳定在所需的分析条件下。
c.设置检测器的参数，如波长、增益、灵敏度等，以适应待测试样品的检测需求。
6.分析运行：a.开始进样和运行色谱，确保流量和压力稳定。
b.监测色谱峰形的变化和信号强度，以评估分离速度和效果。
c.记录每个样品的保留时间和峰高（面积），并进行相应的数据处理和分析。
7.数据处理：a.使用色谱软件导出和处理分析数据，如生成色谱图、峰面积测定、峰高度测定、定量计算等。
b.根据实验目的和要求，对分析数据进行统计学分析、校正和解释。
c.对数据进行结果汇总、报告撰写和存档。
8.后期维护：a.定期检查和维护仪器，如清洁色谱柱、更换零件、校准仪器、更换溶液等，以确保仪器的正常运行和结果的准确性。
b.对废液和废品进行妥善处理，符合环境保护要求。
高效液相色谱 -串联质谱法测定保健酒中西地那非含量摘要：建立高效液相质谱法测定酒中违禁药品西地那非含量方法。
样品采用乙腈超声提取，经安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18分离，梯度洗脱，在LC-MS多反应检测MRM模式下进行定量分析。
结果表明西地那非在0~500ng/ml范围内呈良好的线性关系，回收率97.2-105.4%，RSD(n=5) :1.7%。
关键词：高效液相质谱法保健酒西地那非西地那非商品名为“万艾可”，用于治疗男性勃起功能障碍，属于处方药。
长期服用对人体具有一定危害，对患有心血管系统疾病、高血压、糖尿病患者的身体危害极大，严重者可致心肌梗死。
市场上保健酒品种多，2014年以来，湖北、广西多地就有酒厂因在保健酒中添加伟哥成分药物，称喝某品牌的一瓶125毫升的保健酒相当于吃两粒伟哥。
检验保健酒的检验方法和质量控制标准尚不完善，导致一些保健酒企业铤而走险，钻不规范空子。
”西地那非为处方药，在食品或保健食品等特殊食品中添加属于违法行为，必须予以打击。
因此，建立一种准确、快速的测定方法，为市场安全监管工作提供有效的技术支撑。
1实验部分1.1试药与仪器1.1.1试药：甲醇/乙腈（HPLC级，默克公司）；乙酸铵（优级，国药集团化学试剂）；水（Milli-Q Advantage A10超纯水机制备超纯水）；西地那非标准物质（ Panphy chemicals corporation）1.1.2仪器：液质联用仪 Agilent Technologies 6430 Triple Quad LC/MS1.2仪器条件色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 3.0×100m m 1.8um波长230 nm；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：3μL；流动相：甲醇+乙酸铵(0.1%乙酸)=35+65扫描模式：多反应监测（MRM）ESI+定量离子：475.2 定性离子：58.1 100.1 Frag(V)：1901.3实验方法1.3.1标准储备液的制备：标准物质来源: Panphy chemicals corporation精密称取10mg标准品置20ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即0.5mg/ml。
高效液相色谱法标准操作规程1. 目的建立高效液相色谱法标准操作规程，规范高效液相色谱法检验操作，保证检验操作规范化。
2. 范围适用于高效液相色谱法检验操作。
3. 术语或定义N/A4. 职责质量控制部对本规程的实施负责。
5. 程序5.1依据《中国药典》2020年四部及2019年版《中国药品检验标准操作规范》。
5.2 简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
5.3 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。
5.3.1色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等) 也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂; 分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm(lnm=10A)以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3～10μm之间。
粒径更小(约2μm)的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm) 。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。
对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。
本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。
一、 基本术语基本术语读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）：图1. 典型色谱图1. 保留因子(k)：t t t k R −=(1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。
如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.042. 拖尾因子(T f )液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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aba f W W W T 2+=(2)图2. 典型拖尾峰在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。
如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63.3. 理论塔板数（N ）液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图3. 峰高与峰宽的关系2(16Wt N R= (3) 或2(54.55.0W t N R= (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。
设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=34104. 分离因子(α)10212t t t t k k R R −−==α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。
只有当α>1时，两个色谱峰才有分离的可能性。
设在图1中峰2的保留时间为6.50min, 则分离因子为: (6.50-1.20)/(3.65-1.20)=2.16液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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5. 分离度 (R s )12122W W t t R R R s +−= (6)分离度用于评价色谱分离的品质，通常当R s >1.5时，则认为两峰达到基线分离（完全分离）。
设在图1中峰2的基线峰宽为0.45min ，则峰1与2的分离度为：2*(6.50-3.65)/(0.25+0.45)=8.1上式为分离度的定义公式，用于精确计算两个色谱峰的分离度，而由此可推出如下为色谱工作者的经验公式：1*)1(*4/+−≈k kN R s α (7)该式为经验公式，其目的在于描述分离度与理论塔板数、分离因子和保留值三者之间的关系，多用于指导色谱分离方法的建立，而不用于具体计算。
二、分析方法的建立分析方法的建立（（实例讲解实例讲解））简要介绍了色谱的基本术语，下面用实例来介绍分析方法的建立过程。
1. 准备工作准备工作在进行方法开发的时候，应记住良好的方法要具有以下三个要素：能提供适当的分离度（通常要求R s >1.5）方法运行时间要适中，以利于日常分析方法应具有稳定性，可以在不同实验室之间移植在进行方法开发之前，应该对所分析样品和仪器设备进行信息剖析：样品的来源（单一化合物，生物样品，提取物等）及是否前处理； 样品的溶解度；所分析化合物的结构（是否有官能团，发色基团等）及酸碱性；化合物的分子量（常规小分子，M<1000；生物大分子及聚合物，1000<M<10,000）；仪器配置（柱类型，监测器类型，可否梯度洗脱）； 方法要求（定性，定量，制备，指纹图谱）2. 建立步骤建立步骤在了解了上述信息后，即可进行方法开发了：本例是对含有5个苯取代化合物的样品进行分离。
通过对样品的结构解析，得到如下信息：5个化合物为中性分子，分子量都低于200，在甲醇等有机溶剂中溶解，不溶于水。
含有苯环，在254nm 处有明显的紫外吸收。
在了解以上信息后，并综合文献，选择了Eclipse(Agilent) C18色谱柱, 规格4.6×150mm, 填料粒径5µm 。
液相色谱仪为Agilent 1200 型，配置Chemstation 工作站，VWD 检测器，液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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四元低压梯度泵，柱温箱和自动进样器。
流动相选用乙腈-水系统。
样品直接用甲醇稀释定容。
通常在方法开发之前建议先运行一个全范围的线性梯度洗脱（如0-100%乙腈），它会给后续是否采用等度洗脱还是梯度洗脱提供非常重要的信息。
在本例中，首先运行一个梯度持续时间25min ，乙腈浓度范围为5-100%，流速为1.0ml/min ，检测波长为254nm ，柱温为30o C 。
色谱图如下：图4. 初始梯度运行结果在上述的条件下，所有色谱峰的平均保留因子(k’___)约在4~5之间。
在对上述图谱解析时，会运用到Snyder-Dolan 提出的“1/4规则”：当所有色谱峰的保留范围小于全梯度时间范围的1/4（即25%）时，则建议采用等度洗脱，若大于1/4时，则建议采用梯度洗脱。
在图4中，第一个化合物峰1的保留时间为17.046min, 最末一个化合物峰5的保留时间为19.008min, 整个梯度时间为25min ，计算可得：∆t R /t G (19.008-17.046)/25=0.08<0.25, 则可以运用等度洗脱进行分离。
再仔细分析图谱，发现整个保留范围约在乙腈的高浓度范围内(约70%~75%), 但实际上由于系统的梯度滞后及柱死体积的因素，实际浓度约在60%~65%之间，为使保留因子在1~20范围内，先选择60%乙腈进行等度洗脱，其他条件不变。
色谱图如图5所示：液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图5. 60%乙腈在60%乙腈洗脱条件下，所有峰的保留值范围在2.43~3.86之间，符合保留因子在1~20的条件，但峰1与2完全重叠，4与5也未完全分离。
分离结果不理想，分离条件需要优化。
在前面公式(7)中，提到分离度与柱效（塔板数），选择性（分离因子）和保留值有重要关系，其中柱效跟柱子本身有关，选择性与保留值则与溶剂强度，种类和柱类型有关，但通常在方法开发过程中，不建议频繁更换色谱柱，而是选定一根色谱柱后，依次通过改变溶剂强度，溶剂类型，柱温和流速来获得适当的分离度。
按照溶剂强度改变10%，则保留值改变2~3倍的规则（简称3倍原则，当然这只是一个粗略的经验值，不完全符合所有情况，但在方法开发中能起到不小的作用），接下来运行了50%和40%的乙腈浓度分离条件，色谱图如图6和7所示：液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图6. 50%乙腈在50%乙腈条件下，所有峰的保留值则变化为4.82~8.15，仍满足1<k<20的要求（但与三倍原则稍有出入，变化倍数位1.98~3.35），同时可观察到峰1与2基本达到基线分离，但4与5则重叠更加严重，仍无法满足分离要求。
图7. 40%乙腈在40%乙腈的条件下，所有峰的保留值变化为10.18~19.04，满足1<k<20的要求，同时也大致符合三倍原则（实际变化倍数为2.11~2.33），同时可发现峰1与2的间距更大，但4与5则完全重合，仍无法满足分离要求。
可能会有读者说：可以降液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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低乙腈浓度使4与5分离，但此时降低乙腈浓度会使保留时间延长，不利于日常分离，而且随着保留时间增大，峰宽也会随之变大，仍不会获得满意的分离度。
而且通过上述三个等度试验后，基本上可以确定峰4与5无法在乙腈/水体系下达到基线分离。
另外，根据Snyder 提出的理论：在二元流动相（如甲醇/水，乙腈/水）等度洗脱时，化合物的保留值的对数值与流动相中有机相的浓度成线性关系（仅为经验规则），用数学公式表示既如下：ϕS k k w −=ln ln （8）式中k 为化合物在特定条件下的保留值， k w 为化合物在流动相为水的条件下的保留值（外推理论值），S 为化合物分子特性常数， φ为有机相在流动相中的含量。
通过上述三个试验后，可做出lnk 对φ的线性曲线，如下图所示：图8. lnk-φ曲线（乙腈-水体系）由曲线上可以看出峰4与5几乎近于重合，故此可以推断峰4与5在乙腈/水系统中为难分离峰对。
接下来，可以考虑用溶剂种类来改变分离效果。
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图9. 溶剂强度换算表图10. 溶剂选择三角形在反相色谱法中，常用溶剂为甲醇、乙腈和四氢呋喃，这三种溶剂基于偶极矩作用力、氢键和供（吸）电子的作用提供不同的选择性，在相同溶剂强度下，可对色谱分离起到不同的分离效果，如图9和10所示。
但四氢呋喃的紫外吸收强、易形成过氧化物、平衡较慢，且不与PEEK 管兼容，所以大多不轻易使用。
在上述考虑下，选用甲醇作为有机相来试图改善分离效果。
通过图9中，可以看出70%甲醇与60%乙腈强度相当，故选择70%甲醇进行试验，结果如图11所示：液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图11. 70%甲醇可以发现，甲醇改变了出峰顺序，峰1比峰2后流出，峰3与4完全重叠，峰5与4达到基线分离。
所有峰的保留因子位于2.49~4.36（同60%乙腈相当）。
然后试想是否可以通过甲醇浓度来改变峰3与4的分离效果，接下来，又运行60%甲醇的洗脱试验，结果如图12图12. 60%甲醇液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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可以观察到在60%甲醇条件下，峰1与2重叠，峰3与4分离度有所增加。
所有峰的保留值在 5.24~10.16范围内（大致相当50%乙腈），且大致符合三倍原则。
再根据公式（8）绘制lnk-φ线性图，如图13所示：图13. 甲醇-水体系中lnk-φ曲线从图13中可以看出峰3与4的曲线几近重合，所以在甲醇-水体系中峰3与4为难分离峰对。
接下来，又试验了四氢呋喃-水的分离效果，通过查阅图9，选择45%和35%四氢呋喃进行分离，结果如图14和15液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
