仪器分析实验-高效液相色谱法

第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。

高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。

梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。

也称为梯度淋洗。

低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。

它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。

高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。

它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。

两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。

柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。

柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。

液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。

K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。

液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。

分配系数较大的组分保留值也较大。

正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。

反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。

化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。

仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。

本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。

HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。

相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。

HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。

其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。

HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。

2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。

3.将稀释后的溶液注入进样器中。

4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。

柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。

5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。

6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。

7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。

HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。

例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。

在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。

在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。

总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。

由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。

仪器分析实验报告实验名称：高效液相色谱测定物质浓度一、实验内容1、学习高效液相色谱仪的使用2、利用高效液相色谱法测定溶液中物质的浓度二、实验步骤分别向液相仪注射苯、萘、甲苯、混合四种液体，测定谱图，并利用标准曲线，测定其浓度。

三、数据处理标准曲线：实验数据：0.00.51.01.52.0 2.53.0 3.54.0 4.55.0 5.56.0 6.5min-7.5-5.0-2.50.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.032.535.037.540.042.545.047.550.0mAU254nm,4nm (1.00)1.401/6571311.872/71922.076/440242.315/176632.542/32972.731/14743.338/3466684.311/107074.829/722055.436/3447766.381/5633图四 苯0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5min-10-505101520253035404550556065mAU254nm,4nm (1.00)4.280/810108图五 甲苯0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5min-10010020030040050060070080090010001100mAU254nm,4nm (1.00)1.281/2692011.523/1123671.851/198352.054/339512.313/57782.523/16233.361/56544.306/46304.591/2586585.394/16492918图六 萘0.00.51.01.52.0 2.53.0 3.54.0 4.55.0 5.56.0 6.5min-20-100102030405060708090100110120130140150160mAU254nm,4nm (1.00)1.363/7093351.890/487072.107/685472.299/240562.512/86352.741/134203.331/4865384.265/8520234.813/1162295.403/26525186.383/5382图七 混合数据计算：表一 混合液中各物质保留时间、峰面积及浓度计算物质苯 甲苯 萘 保留时间（min ） 3.331 4.265 5.403 峰面积（mAu ） 496538 852023 2652518 浓度（ug/ml ）339.854374.9208.803四、数据分析1.谱图中存在一定的杂峰，可能是由于溶液被污染2.保留时间存在一定的差异，可能是由于混合溶液中各组分之间会相互影响3.实验中要注意清洗针头，避免相互污染，并且要尽量排除气泡。

高效液相色谱法(HPLC) 是在气相色谱和经典液相色谱的基础上，采用高压泵、高效固定相以及高灵敏度检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。

特点：高压、高柱效、高灵敏度2.HPLC中分离条件的选择：a.固定相与装柱方法的选择:选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp≤10μm)首选化学键合相，匀浆法装柱b.流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相c.柱温的选择:选室温25-30℃左右。

太低流动相黏度增加，太高容易产生气泡第一节液-固色谱法1.液-固色谱法是利用各组分在固定相上的吸附能力不同进行分离的，也称液-固吸附色谱。

2.分离原理.：组分分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面活性中心，靠组分分子的分配比不同而分离。

3.吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及流动相的性质等。

1）组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附;2）组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。

吸附色谱是分离几何异构体的有效手段;不同的官能团具有不同的吸附能力，因此，吸附色谱可按族分离化合物4.固定相：常用的液-固色谱固定相是表面多孔和全多孔微粒型硅胶、氧化铝等。

一般采用5~10μm的全多孔型微粒。

这些吸附剂的极性都比较大，对非极性组分的保留能力较弱，与极性化合物的相互作用较强。

5.流动相：在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。

液-固色谱的流动相必须符合下列要求:1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。

2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。

3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。

4）应与所用检测器相匹配。

例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。

5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜。

第二节化学键合相色谱法1.液液分配色谱法分离原理：根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，在两溶液间进行不同分配而实现分离。

高效液相色谱1．高效液相色谱法的特点特点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量准确度高，应用围广。

适用于分析高沸点、大分子、强极性、热不稳定有机及生化试样的高效别离分析方法。

2.高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：(1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；(2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级；(4)由于流动相的化学成分可进展广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率〔柱效能〕；(5)高效液相色谱采用5~10Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；(6)高效液相色谱是在液相中进展，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。

3.高效液相色谱的定性和定量分析的方法定性：〔1〕利用纯物质定性的方法利用保存值定性：通过比照试样中具有与纯物质一样保存值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。

不适用于不同仪器上获得的数据之间的比照。

利用参加法定性：将纯物质参加到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。

〔2〕利用文献保存值定性相对保存值r21：相对保存值r21仅与柱温和固定液性质有关。

在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保存数据，可以用来进展定性鉴定。

定量：有归一法、标法、外标法在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、标法或外标法等，但高效液相色谱在别离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而标法定量则被广泛使用。

4．高效液相色谱实验时，选择流动相时应注意的几个问题〔1〕尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。

第二章高效液相色谱分析§2.1 高效液相色谱法概述（掌握）2.1.1 高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较2、与气相色谱法比较3、高效液相色谱法的发展A、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。

目前，出现使用1.0µm填料的超高压液相色谱。

B 、流动相变化目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID 和FPD 检测器的HPLC 。

C 、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC 与MS 、NMR 、IR 联用的多维液相色谱法。

4、高效液相色谱法的特点①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。

（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；④高灵敏度：10—9g （UV ）；10—11g （荧光检测）。

5、高效液相色谱法的局限①溶剂用量太大；②缺乏诸如气相色谱使用的TCD 、FID 通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa ～1MPa 压力。

§2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。

现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：高效液相色谱的范氏方程：2222m p sm p s fd m p mm s C d C d C d C D H d u u u D D D λ⎛⎫=++++ ⎪ ⎪⎝⎭ 若将上式简化，可写作：BH A Cu u=++这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。

仪器分析—高效液相色谱法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和定量化学物质的分析技术。

它广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。

HPLC的原理基于样品在流动相中的分配行为，通过调节流动相成分和流速，实现对样品中化合物的分离和定量。

HPLC的特点之一是分离效率高。

其分析柱内有高效填料，通常是细小颗粒的吸附剂，能够提供大的表面积，有效地增加了分析柱与流动相接触的面积，从而提高了分离能力。

此外，在HPLC中还可以根据需要选择适当的流动相，调节柱温和压力等条件，进一步优化分析条件，提高分离效果。

其次，HPLC的灵敏度高。

在HPLC中，使用的检测器通常有紫外-可见光谱法、荧光法、质谱法等。

这些检测器可以实现对特定化合物的高选择性检测，而且还能够对不同化合物进行同时检测。

对于低浓度的化合物，可以通过选择合适的检测器和优化分析条件，提高检测灵敏度，使得即使在样品中含量很低的化合物也能够被准确地检测到。

此外，HPLC在分析速度和样品处理方面也比较快捷。

与传统的柱色谱技术相比，HPLC使用的高压泵可以提高流动相的速度，从而缩短分析时间。

对于样品预处理方面，使用HPLC时只需要进行简单的处理，如溶解样品并过滤，就可以直接进入分析阶段。

这使得HPLC具有高通量分析的优势，能够在短时间内快速分析大量样品。

此外，HPLC还可与其他技术结合应用。

例如，HPLC-质谱联用技术可以实现对样品中化合物的分离和结构的同时鉴定，具有非常高的分析灵敏度和选择性。

HPLC还可以与色谱预处理、液相萃取和样品前处理等技术结合，提高样品的净化效果和检测灵敏度。

综上所述，HPLC是一种高效、灵敏和多功能的分析技术，被广泛应用于各个科学领域。

它的分离效率高，灵敏度高，分析速度快，样品处理简便，可以与其他技术结合使用，提高分析的效果和可靠性。

在今后的科学研究和实际应用中，HPLC将继续发挥重要的作用。

华南师范大学实验报告学生姓名：杨秀琼学号：20082401129专业：化学年级班级：08化二课程名称：仪器分析实验实验项目：液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯实验类型：综合实验时间：2010/416一、[实验目的:]1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术二、[实验原理:]高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。

它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。

具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。

其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即由不同的分配系数），当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的分配系数只有微小差异，随着液体流动相却可以有明显的差异，最后使这些组分都得到分离，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

三、[仪器和试剂:]1.主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测PhenomenexO柱]；10μL微量注射器2、试剂：甲醇、水苯和甲苯混合待测溶液苯标准溶液：2.0μL/mL甲苯标准溶液：2.0μL/mL苯、甲苯混合标准溶液：1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL、10.0μL/mL 四、[实验步骤]1、按操作规程开机。

2、.选择合适的流动相配比，优化色谱条件通过调节溶剂甲醇和水的混合比例，从而来优化色谱调剂。

调好最佳色谱条件，控制流速为1ml/min 。

柱温30℃，检测波长354nm 3、苯、甲苯定性分析在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL 微量注射器分别进样10μL 苯和 甲 苯混合待测溶液，10μL 苯标准溶液（2.0μL/mL）和10μL 甲苯标准溶液（2.0μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3～5遍)，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。