3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)试剂盒说明书

货号：MS2205 规格：100管/96样3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)试剂盒说明书微量法正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

测定原理3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3 二磷酸甘油酸。

GAPDH逆向催化 1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH 活性的高低。

需自备的仪器和用品分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；试剂三：液体×1 支，4℃保存；样本的前处理1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热10分钟；现配现用。

生物化学糖试题集及答案一、选择题（每题2分，共20分）1. 糖酵解过程中，下列哪种酶催化的反应不可逆？A. 己糖激酶B. 磷酸果糖激酶-1C. 丙酮酸激酶D. 乳酸脱氢酶答案：C2. 糖酵解过程中，哪种物质是限速酶？A. 己糖激酶B. 磷酸果糖激酶-1C. 丙酮酸激酶D. 乳酸脱氢酶答案：B3. 糖酵解过程中，哪种物质是关键的调节因子？A. ATPB. NADHC. 柠檬酸D. 丙酮酸答案：A4. 糖酵解过程中，哪种物质是最终产物？A. 丙酮酸B. 乳酸C. 二氧化碳和乙醇D. 葡萄糖-6-磷酸答案：B5. 糖酵解过程中，哪种物质是丙酮酸激酶的激活剂？A. 柠檬酸B. 丙酮酸C. 果糖-1,6-二磷酸D. 葡萄糖-6-磷酸答案：C6. 糖酵解过程中，哪种物质是丙酮酸激酶的抑制剂？A. ATPB. NADHC. 柠檬酸D. 丙酮酸答案：A7. 糖酵解过程中，哪种物质是己糖激酶的抑制剂？A. ATPB. NADHC. 柠檬酸D. 丙酮酸答案：A8. 糖酵解过程中，哪种物质是磷酸果糖激酶-1的抑制剂？A. ATPB. NADHC. 柠檬酸D. 丙酮酸答案：A9. 糖酵解过程中，哪种物质是磷酸果糖激酶-1的激活剂？A. ATPB. NADHC. 柠檬酸D. 丙酮酸答案：C10. 糖酵解过程中，哪种物质是乳酸脱氢酶的底物？A. 丙酮酸B. 乳酸C. 果糖-1,6-二磷酸D. 葡萄糖-6-磷酸答案：A二、填空题（每题2分，共20分）1. 糖酵解过程中，_________是第一个限速步骤。

答案：己糖激酶2. 糖酵解过程中，_________是第二个限速步骤。

答案：磷酸果糖激酶-13. 糖酵解过程中，_________是第三个限速步骤。

答案：丙酮酸激酶4. 糖酵解过程中，_________是最终产物。

答案：乳酸5. 糖酵解过程中，_________是丙酮酸激酶的激活剂。

答案：果糖-1,6-二磷酸6. 糖酵解过程中，_________是丙酮酸激酶的抑制剂。

3磷酸甘油醛脱氢酶糖无氧氧化（最新版）目录1.3-磷酸甘油醛脱氢酶简介2.糖无氧氧化过程3.3-磷酸甘油醛脱氢酶在糖无氧氧化中的作用4.3-磷酸甘油醛脱氢酶的应用5.结论正文3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，简称 GAPDH）是一种参与糖酵解途径的酶，主要作用是在细胞溶酶体内进行氧化还原反应。

糖无氧氧化是一种在无氧条件下将葡萄糖分解为乳酸或酒精和二氧化碳的过程，这一过程在生物体内有着重要的生理意义。

本文将从 3-磷酸甘油醛脱氢酶的角度，探讨糖无氧氧化的过程及其应用。

在糖无氧氧化过程中，葡萄糖首先被磷酸化为葡萄糖 -6-磷酸（G6P），然后转化为果糖 -6-磷酸（F6P），接着果糖 -1,6-双磷酸（F1,6BP）产生，这个过程需要消耗一个 ATP 分子。

随后，F1,6BP 裂解为两个三磷酸甘油醛（3-phosphoglyceraldehyde，3-PGAL），此时 3-磷酸甘油醛脱氢酶发挥作用，将一个 3-PGAL 转化为磷酸二羟基丙酮酸（DHAP），同时产生一个 ATP 分子。

然后，DHAP 通过一系列反应转化为丙酮酸，最后生成乳酸或酒精和二氧化碳。

3-磷酸甘油醛脱氢酶在糖无氧氧化过程中起到了关键作用，它将一个不稳定的化合物 3-PGAL 转化为稳定的 DHAP，同时产生一个 ATP 分子，为细胞提供了能量。

此外，3-磷酸甘油醛脱氢酶还有其他功能，例如参与氧化应激反应、调控细胞生长等。

3-磷酸甘油醛脱氢酶在生物体内有着广泛的应用。

首先，由于其在糖无氧氧化过程中的关键作用，3-磷酸甘油醛脱氢酶可以作为研究糖酵解途径的重要靶点。

其次，3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性可以作为评估细胞状态的指标，例如在缺氧、氧化应激等条件下，3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性会发生变化。

最后，3-磷酸甘油醛脱氢酶还可以应用于生物医学领域，例如在肿瘤诊断、评估治疗效果等方面有着潜在的应用价值。

基因表达的半定量PCR检测实验目的：以cDNA为模板，利用PCR技术制备目的基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的大量拷贝，以便进行目的基因的克隆；此实验还包括PCR引物设计，PCR产物的琼脂糖电泳检测等内容。

实验原理：真核细胞含有三类基本RNA：核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）。

其中mRNA传递合成蛋白质的全部遗传信息，是蛋白质生物合成的中间环节，具有特殊意义。

Trizol试剂可从细胞中快速提取细胞总RNA，将其中的mRNA逆转录成cDNA，以一对特异性引物对目的cDNA进行聚合酶链式反应扩增。

由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数呈几何级数增长，因此，30次PCR循环将产生约1亿倍（230）的扩增片段。

PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管）扩增核酸的技术。

该技术模拟体内天然DNA的复制过程。

其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。

每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。

每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。

PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性（图3-1）。

PCR反应的基本步骤包括高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension）三步反应（图3-2）。

①变性（denaturation）（95℃）；②退火(annealing)；③延伸(elogation)（72℃）图3-1 PCR扩增DNA原理示意图图3-2PCR实验中各种组分的剂量：（1）dNTP常用浓度为20~200μM，不能低于10~15μM。

GAPDH一概述GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。

该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。

该酶基因为看家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。

GAPDH结构图常用的内参有，ACTB（β-actin、β-肌动蛋白）、GAPDH或18S等。

目的是在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温差等所造成的误差、这些都是看家基因，在各个组织中的表达量相对稳定，其中18S同整个基因谱有关（负责装配），它在总RNA中占的比例最高。

转染了GAPDH siRNA.jpg转染了GAPDH siRNA的Hela细胞转染了GAPDH相关siRNA的HeLa细胞在转染后48小时后不断增殖。

红：被标记的siRNA；蓝：被染色的细胞核；绿色：GAPDH蛋白；（这些siRNA 锐博生物均可提供）阴性对照（scrambled siRNA）的导入（左）对GAPDH蛋白的表达没有影响，不过若转入一个以GAPDH（右）为靶标的siRNA，则会导致GAPDH蛋白表达水平的急剧下降。

二GAPDF作为内参GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。

GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。

因为GAPDH 作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。