3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测试剂盒说明书 微量法

3磷酸甘油醛脱氢酶负协同效应1. 介绍3磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）是一种广泛存在于生物体中的酶，参与细胞内糖酵解途径中的关键步骤。

磷酸甘油醛脱氢酶催化的反应是糖酵解过程中产生ATP的关键步骤之一。

然而，近年来的研究发现，GAPDH在细胞内还具有许多其他功能，其中之一就是负协同效应。

负协同效应是指某一物质在存在其他物质的情况下，其活性或功能受到抑制或降低的现象。

在GAPDH中，负协同效应主要指的是当细胞内存在某些调控因子时，GAPDH的酶活性会受到抑制或降低。

这些调控因子可以是其他酶、蛋白质、小分子化合物等。

2. 负协同效应的机制目前，关于GAPDH负协同效应的机制还存在一定的争议，但已经有一些研究取得了重要的进展。

以下是一些目前已知的GAPDH负协同效应的机制：2.1. 蛋白质相互作用GAPDH可以与许多其他蛋白质发生相互作用，这些相互作用可能导致GAPDH的酶活性受到抑制。

例如，研究发现，GAPDH可以与肿瘤抑制因子p53相互作用，并抑制其转录活性。

此外，GAPDH还可以与一些转录因子相互作用，影响其转录活性。

2.2. 磷酸化修饰磷酸化修饰是细胞内常见的一种调控机制，可以改变蛋白质的结构和功能。

研究表明，GAPDH的酶活性可以通过磷酸化修饰发生变化。

一些研究发现，当GAPDH被磷酸化时，其酶活性会受到抑制。

磷酸化修饰可以通过激酶的作用进行，也可以通过磷酸酶的作用进行逆反应。

2.3. 产物抑制在糖酵解过程中，GAPDH催化磷酸甘油醛与NAD+反应生成磷酸甘油酸和NADH。

研究发现，当NADH的浓度较高时，它可以与GAPDH结合形成复合物，从而抑制GAPDH的酶活性。

此外，其他代谢产物，如ATP、ADP等，也可以通过类似的机制抑制GAPDH的酶活性。

3. 生理意义GAPDH负协同效应在细胞内具有重要的生理意义。

首先，通过调控GAPDH的酶活性，细胞可以控制糖酵解过程的速率，以适应不同的代谢需求。

甘油醛3-磷酸脱氢酶甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是一种重要的蛋白质，它在生物体内起着重要的作用。

GAPDH存在于几乎所有生物种类，包括细菌、动物和植物。

它是一个由四个亚基组成的四聚体，每个亚基含有一个催化中心。

GAPDH可以在细胞内的糖酵解途径、Gluconeogenesis 途径和细胞凋亡中发挥重要的作用。

GAPDH在糖酵解途径中的作用是将葡萄糖转化为丙酮酸。

在这个过程中，GAPDH将葡萄糖分子氧化为葡萄糖6-磷酸酸，然后，葡萄糖6-磷酸酸进一步分解为丙酮酸和磷酸二羧酸，GAPDH就是催化葡萄糖6磷酸酸和磷酸二羧酸互相转化的关键酶。

这个过程同时释放了能量，产生ATP和NADH。

GAPDH还参与了细胞凋亡中的过程。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的重要形式。

在细胞凋亡过程中，GAPDH通过与Siah1相互作用，促进了肿瘤坏死因子-α介导的细胞凋亡。

GAPDH与Siah1相互作用后，可以增强Cdk5激活的受体神经元1（NR1）的降解，从而加强细胞凋亡。

在Gluconeogenesis途径中，GAPDH的作用相当于磷酸甘油脱氢酶（G3PDH），它可以将丙酮酸还原为葡萄糖6磷酸酸，从而增加葡萄糖的储存量。

除此之外，GAPDH在细胞内通过与其他蛋白质的相互作用参与了很多其他的生物过程，例如运输、蛋白质合成等。

虽然GAPDH的作用十分重要，但是它也参与了一些其他非正常的生物过程中。

例如，当细胞受到压力时，会增加GAPDH的表达，这种过度表达会导致细胞的凋亡。

此外，GAPDH 还可以在疾病的发生发展中发挥作用。

例如，GAPDH的过度表达在癌细胞中广泛存在。

GAPDH还可以通过和其他蛋白质的相互作用参与神经性疾病的发生和发展。

综上所述，甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是一种常见的酶，参与了多种生物过程，包括糖酵解途径、Gluconeogenesis途径和细胞凋亡。

与此同时，GAPDH也参与了一些异常生物过程，包括癌症、神经性疾病等。

2023—2024 学年度东北育才学校高中部高三第三次模拟考试生物科试卷一、单选题(每小题只有一个正确选项，每小题2分，共30分)1. 已知生物毒素a 是由蛋白质b 经过糖链修饰后得到的糖蛋白，通过胞吞进入细胞，可专一性地抑制核糖体的功能。

为研究a 的结构与功能的关系，某小组取生物毒素a 、蛋白质b 和c(c 由a 经高温加热处理获得，糖链不变)三种蛋白样品，分别加入三组(对应a 、b 、c 组)等量的某种癌细胞(X)培养物中，适当培养后，检测X 细胞内样品蛋白的含量和X 细胞活力(初始细胞活力为100%)，结果如图所示。

下列分析不合理的是（ ）A. 动物细胞中，蛋白质的糖链修饰可能发生在内质网中B. 糖蛋白a 进入细胞与蛋白质b 是否变性关系不大C. 生物毒素a 对细胞活力D. a 组细胞内蛋白质的合成量与c 组的差异不大2. 核基因编码的线粒体蛋白首先在核糖体上合成前体蛋白，前体蛋白由成熟蛋白和导肽序列共同组成。

导肽含有识别线粒体的信息，同时也具有牵引蛋白质靠近线粒体外膜与内膜间形成的接触点，并通过相应的通道进入线粒体基质的功能。

已知线粒体基质带负电荷。

下列叙述错误的是（ ）A. 导肽分子含有决定蛋白质去向的信息B. 导肽序列中的部分氨基酸可能带正电荷C. 细胞核也参与线粒体相关生命活动的控制D. 前体蛋白的加工需内质网和高尔基体参与3. 细胞膜H +-ATP 酶(PMA)是植物体内一类重要的质子泵，也是一种极其关键的转运蛋白。

PMA 通过消耗ATP 将细胞质中的H +排出，为养分离子的跨膜转运，以及有机酸和生物硝化抑制剂等物质的分泌提供细胞膜电位和质子驱动力。

PMA 通过维持细胞膜电位和细胞pH 的平衡，在植物根系生长，以及土壤中氮、磷、钾等营养成分的活化与吸收中发挥作用。

下列叙述不正确的是（ ）A. PMA 转运H +的方式属于主动运输B. PMA 活性受限制后会加重土壤酸化C. 蛋白质变性剂会影响细胞对离子的吸收D. PMA基因的表达会受环境因素的影响的4. 玉米等C4植物对空气中二氧化碳的浓度要求比较低，这主要与玉米的光合作用方式有关。

4谷氨酸脱氢酶（GDH ）活性检测试剂盒说明书货号：UPLC-MS-4442规格：50T/48S紫外分光光度法产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶4℃保存试剂一液体60mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1瓶-20℃保存溶液的配制：工作液的配制：临用前将试剂一加入试剂二中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min 。

产品说明：GDH （EC 1.4.1.2）广泛分布于植物中，和谷氨酸合成酶（GOGAT ）共同参与谷氨酸的合成，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。

GDH 催化NH +、α-酮戊二酸和NADH ，生成谷氨酸和NAD +，引起340nm 吸光度下降。

通过测定340nm 吸光度的下降速率，计算GDH 活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤1.紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm ，蒸馏水调零。

2.样本测定：取1mL 工作液和0.05mL 样本于光径为1cm 的1mL 石英比色皿中，混匀，加样本的同时开始计时，在340nm 波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)ELISA试剂盒使用说明书产品编号：D711286包装规格：48 TESTS / 96 TESTS声明：使用前仔细阅读本说明书。

只能用于研究用途，不得用于医学诊断。

用途用于人血清、血浆或其他相关生物液体中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的测定。

工作原理本试剂盒采用的是双抗夹心酶联免疫吸附检测技术（ELISA）。

测定样品中人甘油醛-3-磷酸脱氢酶水平。

向预先包被了抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体的酶标孔中，加入标准品和样本，温育后，加入生物素标记的抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体。

再与HRP标记的链霉亲和素结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入显色底物TMB，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

最后，在450 nm处测定反应孔样品吸光度（OD）值，样本中的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线计算出样本中人甘油醛-3-磷酸脱氢酶的浓度。

1 / 262 / 26原理图：试剂盒组成说明书1份1份封板膜5片5片预包被酶标板8孔X 6条8孔X 12条-20°C 标准品1瓶2瓶-20°C 标准品/样本稀释液SD120 mL X 1瓶20 mL X 1瓶2-8°C 浓缩生物素标记甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体（100X ）60 μl120 μl-20°C生物素标记抗体稀释液SD214 mL X 1瓶14 mL X 1瓶2-8°C浓缩HRP 标记链霉亲和素（100X ）60 μl120 μl-20°C （避光）HRP标记链霉亲和素稀释液SD314 mL X 1瓶14 mL X 1瓶2-8°C显色剂10 mL X 1瓶10 mL X 1瓶2-8°C （避光）终止液10 mL X 1瓶10 mL X 1瓶2-8°C浓缩洗涤液（25×）30 mL X 1瓶30 mL X 1瓶2-8°C需要而未提供的试剂和器材1.37°C恒温箱2.酶标仪（450 nm波长滤光片）3.精密移液器及一次性吸头4.去离子水或蒸馏水5.一次性试管6.洗板机或洗瓶，吸水纸注意事项1.试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶乙二醇基-3-磷酸脱氢酶（glycerol-3-phosphate dehydrogenase，简称GPDH）是一种半胱氨酸腺嘌呤双加氧酶，它可以完成乙二醇-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，简称G3P）和NAD+的氧化还原反应。

GPDH的氧化剂是NAD+，而被氧化反应物是G3P。

在泛素化过程中，GPDH还能够氧化G3P和NAD+合成二磷酸核糖腺嘌呤（DPGA）和NADH，换句话说，GPDH可以将G3P转换成DPGA。

GPDH是一种非常重要的酶，在多种生物体中都有所表现，它以各种形式存在于植物、动物和微生物的细胞中。

GPDH在细胞的代谢中发挥着重要作用，它可以调节氧化还原反应，从而维持细胞中能量的稳定性和正常的生物学功能；GPDH还可以通过DPGA的合成为糖异构酶（glycogen synthase）提供氮源，促进糖原的合成。

GPDH的结构丰富多变，有线粒体内GPDH、植物细胞质GPDH、植物细胞膜GPDH以及动物细胞膜GPDH等。

它们均为高度保守的多重位点型蛋白质，其分子大小均为50-60 kDa，分子量可以达到两万多。

GPDH可以经过典型性结构变换来完成其活性过程，这些结构变换通常由酶本身和周围环境（如pH值、温度、活性离子浓度）之间的相互作用来构建。

GPDH的活性是高度可调的，主要受周围环境中的酸碱度和温度影响，它可以在低温条件下（约4℃）保持其基本功能，在常温条件下（约37℃）保存最佳的活性。

通常情况下，pH值介于5.5-7.5之间都能够支持GPDH的最佳活性。

GPDH在活性过程中是特异性的，可以有效催化乙二醇-3-磷酸和NAD+之间的反应，但是它对于其他类似结构的供体或受体（如乙二醇-1-磷酸、乙二醇和NADP+）的作用很少。

GPDH的应用范围很广，它可以用来研究细胞的能量代谢以及糖原的合成和分解，也可以用来诊断肝病、心脏病和其他器官疾病，还可以用来建立发酵工艺，例如研究乳酸发酵，可用GPDH来检测活性乙二醇-3-磷酸和乙醇的代谢表达。

GAPDH一概述GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。

该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。

该酶基因为看家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。

GAPDH结构图常用的内参有，ACTB（β-actin、β-肌动蛋白）、GAPDH或18S等。

目的是在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温差等所造成的误差、这些都是看家基因，在各个组织中的表达量相对稳定，其中18S同整个基因谱有关（负责装配），它在总RNA中占的比例最高。

转染了GAPDH siRNA.jpg转染了GAPDH siRNA的Hela细胞转染了GAPDH相关siRNA的HeLa细胞在转染后48小时后不断增殖。

红：被标记的siRNA；蓝：被染色的细胞核；绿色：GAPDH蛋白；（这些siRNA 锐博生物均可提供）阴性对照（scrambled siRNA）的导入（左）对GAPDH蛋白的表达没有影响，不过若转入一个以GAPDH（右）为靶标的siRNA，则会导致GAPDH蛋白表达水平的急剧下降。

二GAPDF作为内参GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。

GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。

因为GAPDH 作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。

糖酵解途径中3-磷酸甘油醛脱氢酶催化
糖酵解是一个非常重要的生化途径，它能够将葡萄糖等糖类分子转化为能量和有机物质。

该途径中的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）是一个重要的催化酶，它能够催化3-磷酸甘油醛与NAD+之间的氧化还原反应，从而生成1,3-二磷酸甘油和NADH。

GAPDH是一个由四个亚基组成的四聚体，每个亚基都含有一个催化位点。

该酶的催化作用可以分为三个步骤：底物结合、催化反应和产物释放。

在底物结合步骤中，3-磷酸甘油醛首先与GAPDH的活性位点结合，形成一个中间复合物。

该步骤是一个不可逆过程，越高的底物浓度会增加复合物的形成速率。

在催化反应步骤中，3-磷酸甘油醛与亚基中的催化位点发生氧化还原反应，将3-磷酸甘油醛氧化为1,3-二磷酸甘油。

该反应需要一个还原剂，而NAD+正好是这个还原剂。

GAPDH将NAD+还原为NADH，同时将3-磷酸甘油醛氧化为1,3-二磷酸甘油。

这个步骤是一个可逆过程，但是反应向前的趋势非常强。

在产物释放步骤中，1,3-二磷酸甘油脱离催化位点，转化为GAPDH上的另一个位点。

同时，NADH也释放出来，但是它还会停留在GAPDH附近的NADH位点上。

3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号：BC2210规格：25T/24S50T/48S产品内容：提取液：30mL×1瓶，4℃保存；试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存；试剂三：液体15µL×1支，4℃保存；临用前加入0.5mL蒸馏水充分混匀，或根据比例现配现用；用不完的试剂4℃保存一周。

产品说明：GAPDH（EC1.2.1.12）催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。

GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3-磷酸甘油醛、无机磷和NAD+，340nm处测定NADH的减少量可反映GAPDH活性的高低。

试验中所需的仪器和试剂：紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、粗酶液提取：组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

小鼠GAPDH基因的克隆、表达与鉴定学号学生姓名指导教师2016年4月12日摘要甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3·phosphate dehydrogenase，GAPDH)是一种分布在细胞质中、在糖酵解过程中起关键作用的酶。

但是近年来，越来越多的研究表明GAPDH 是一种多功能蛋白，参与tRNA出核、mRNA稳定性调节、DNA损伤修复、组蛋白转录调控、凋亡及神经退行性疾病发生等。

在细胞质和生物膜上也有重要作用。

本文主要介绍利用基因工程实验技术操作GAPDH基因，采用Trizol 法从小鼠肝脏组织中提取总RNA，并运用RT-PCR 方法克隆了GAPDH基因，连接到pET28a载体上, 并导入感受态的DH5α与BL21菌中筛选鉴定。

选取鉴定正确的转化BL21克隆诱导表达GAPDH蛋白质，用SDS-PAGE和Western Blot 鉴定。

关键词: 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)；基因表达; 载体；RT- PCR。

绪论甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3·phosphate dehydrogenase，GAPDH)是参与糖酵解的一种关键酶，催化3-磷酸甘油醛转变为l，3．二磷酸甘油醛，同时以NAD+为受氢体生成NADH。

由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。

该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。

近年来，研究发现GAPDH在细胞质、细胞核及细胞膜上均有定位，其表达量在转录及转录后水平受到调节，mRNA水平和蛋白水平会随着各种刺激而变化。