常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色

一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。

Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。

3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。

4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。

6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。

Slide 8:7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。

8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。

染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。

三步法（SP系列），实验步骤使用说明：SP9001（兔）适用于兔来源的一抗SP9002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗SP9003 （山羊）适用于山羊来源的一抗SP9000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格￥230.00 / 6.0ml- 价格￥380.00 / 18ml- 价格￥1080.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年一﹑试剂盒内容试剂1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含10%驴血清）即用型试剂2 生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊）即用型试剂3 链酶卵白素-碱磷酶轭合物即用型试剂3 过氧化物酶标记链酶卵白素即用型实验步骤简介：1. 细胞爬片：冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，置0.1mol PBS 室温10分钟复水。

2. 修复：滴加复合消化液（0.125胰蛋白酶% +0.1胃蛋白酶%+0.01 EDTA% ）（0.1molPBS 配制）4度30-40分钟0.1mol PBS 洗三次，每次一分钟3. 血清封闭：（试剂1）室温10分钟，倾去。

4. 一抗：37℃1小时或4度过夜5. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟6. 相应的生物素化二抗（试剂2）37℃30-40分钟7. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟8. 链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂3）37℃40分钟9，NBT/BCIP或DAB显色，切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。

灏洋生物15:14:49名称：connexin 43产品编号：CM7269价格/规格：0.1ml/20ug技术指标：小鼠抗人，大鼠，小鼠单克隆抗体Ig分类：IgG2a适用组织：冰冻/石蜡阳性部位：细胞浆组织处理：0.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）产品说明：产地: Cellscience二步法（无生物素PV6000系列），实验步骤使用说明：试剂盒组成试剂A: 3% H2O2试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）PV6001（兔）适用于兔来源的一抗PV6002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗PV6000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格￥300.00 / 6.0ml- 价格￥580.00 / 18ml- 价格￥1780.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。

免疫组化（SP 法） 第一天 (5h)准备：60℃ 烘片2-4h1. 二甲苯脱蜡1 30min2. 二甲苯脱蜡2 30min3. 100% 乙醇 10min 2次4. 95% 乙醇 3min5. 85% 乙醇 3min6. 75% 乙醇 3min7. ddH 20 1min 2次 轻晃以防掉片8. 抗原修复：使用1L 烧杯，9ml 柠檬酸（0.1M 现配）溶液和41ml 柠檬酸钠（0.1M ）加450ml ddH 20（ph=6）罩上锡纸，封烧杯口，扎洞若干，煮沸20min （可先煮沸再放片子，也可以先放片子再一起煮，温度先调至420℃多，煮沸后调到250℃左右，计时15-20min ）之后自然冷却（30-40℃） 9ml 柠檬酸配法：9ml ddH 20加0.18g 柠檬酸。

可以直接称取0.18g 柠檬酸加41ml 柠檬酸钠加450ml 水0.1M 柠檬酸钠配法：29.41g 柠檬酸钠加入1L 蒸馏水中，或14.7g 加入500ml 蒸馏水中9. 3%H 202孵育10min （200ml，盒子装，现配，用甲醇稀释30%H 202至3%H202）以消除内源性过氧化物酶活性（内源性过氧化物酶能与HRP 反应，造成假阳性），PBS 冲洗3min 3次10. 加试剂A （山羊血清，起到封闭作用）一滴（蓝色）室温孵育10-15min 盖盖防干，倾去勿洗，先甩再擦（试剂A,B,C 放在1号冰箱侧门，擦干玻片，放在湿盒里，盒子两侧不要放玻片，以防接触到盒壁，抗体流出，要求试剂刚好覆盖组织，全部滴完计时10min ，用黄枪头抹匀试剂）11. 加一抗，4℃过夜，25-50ul 每个组织，一抗用PBS 稀释，4℃放置，加完一抗后，先不要盖盖，放到冰箱里后再盖盖第二天(3h)12.PBS 3min 3次（将1xPBS倒进盒子里，里面放架子，片子甩干后放进架子里）13.加试剂B（黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂B是生物素化的二抗，能与一抗结合）14.PBS 3min 3次15.加试剂C（橙黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂C是HRP标记的链霉亲和素，一个亲和素可以与四个生物素非共价键结合，不可逆，结合紧密。

常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。

S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

2. 基本染色方法：（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。

（4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。

（5）PBS冲洗，5分钟×3次。

（6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10～30分钟; 或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。

（7）PBS冲洗，5分钟×3次。

（8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释)，37℃孵育10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。

（9）PBS冲洗，5分钟×3次。

（10）显色剂显色（DAB或AEC）。

（11）自来水充分冲洗，复染，封片。

（附，冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。

用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×2次。

免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。

免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取岀来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。

通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。

组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。

它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。

当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发岀一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。

由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。

2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。

基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。

免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。

两种常用的免疫组化染色方法对NOS染色效果的比较居培;余红民
【期刊名称】《生物技术世界》
【年(卷),期】2016(000)004
【摘要】目的比较ABC法和SP法两种免疫组织化学染色方法的染色效果.方法通过免疫组化检测一氧化氮合酶的三个亚型的蛋白iNOS、eNOS和nNOS的表达,观察三种蛋白的染色结果.结果 SP法检测iNOS和eNOS的敏感性要明显强于ABC法;SP法蛋白染色结果明显优于ABC法.结论 SP法检测NOS优于ABC法.【总页数】2页(P7-8)
【作者】居培;余红民
【作者单位】徐州医学院公共卫生学院实验教学中心，江苏徐州221004
【正文语种】中文
【中图分类】R392-33
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一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。

Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃烤箱烤片15小时以上→从烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ中5~10 min→二甲苯Ⅱ5~10min →无水乙醇5min →95%乙醇5min →80%乙醇5min →70%乙醇5min →自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。

3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。

4、滴加5~10%正常山羊血清封闭，37℃, 10min (消除背景非特异性着色)Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min 。

6、擦干组织周围PBS，滴加生物素标记的第二抗体，37℃, 孵育20min，PBS洗3次，每次5min。

Slide 8:7、擦干组织周围PBS，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37℃, 孵育20min。

8、PBS洗3次，每次5min，D.W洗2次，DAB显色(DAB必须现用现配)，镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。

染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。

常用免疫组化染色方法(一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。

2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟。

3. 无水酒精Ⅰ 30秒。

4. 无水酒精Ⅱ 30秒。

5. 95%酒精Ⅰ 30秒。

6. 95%酒精Ⅱ 30秒。

7. 90%酒精 30秒。

8.80%酒精 30秒。

9. 70%酒精 30秒。

10.自来水洗。

(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

12.水洗。

13.抗原修复。

14.PBS洗3次，1分钟/次。

15.加入血清孵育20分钟。

16.摔干血清，加入一抗60分钟。

17.PBS洗3次，2分钟/次。

18.加入二抗孵育30分钟。

19.PBS洗3次，2分钟/次。

20.加入ABC复合物，孵育30分钟。

21. PBS洗3次，2分钟/次。

22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。

23.PBS洗，水洗。

24.Harris苏木素染核5-10分钟。

25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(二)、LSAB法。

(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

3.水洗。

4.抗原修复。

5.PBS洗3次，1分钟/次。

6.加入血清孵育10分钟。

7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。

8.PBS洗3次，每次2分钟。

加入二抗，孵育20分钟。

9.PBS洗3次，每次2分钟。

10.加入SP复合物孵育20-30分钟。

11.PBS洗3次，每次2分钟。

12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。

13.PBS洗，水洗。

14.Harris苏木素染核5-10分钟。

15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。

2. 0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3. 水洗。

4.如果需要，可进行抗原修复。

5.PBS洗3次，每次1分钟。

免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。

免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体(第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,形成抗原—一抗—二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）.通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量.组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术.它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。

由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。

2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。

基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。

免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。

免疫组化SP 法一．实验原理SP 法是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。

链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量47000. 同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。

亲和素是一个碱性蛋白质（IP=10），经改造后可以转变为中性蛋白质。

链霉亲和素等电点接近中性，IP=6.0~6.5 ，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。

根据研究，SP 大约可形成一百万个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所形成的复合物。

大量的酶将保证SP具有很高的敏感性。

SP兼具高敏感性，低背景和操作简便的优点。

三．操作步骤1．载玻片防脱片处理：可选择APES，捞片后置烤箱60℃60min 以使切片紧密粘附。

2．切片常规脱蜡3．30%过氧化氢1 份+蒸馏水10 份混合，室温10min 以灭活内源性酶。

蒸馏水洗 3 次4．热修复抗原：将切片浸入0.01M 构橼酸盐缓冲液（PH6.0），高压3min，之后冷却20min，再用PBS洗。

5．滴加5%BSA封闭液，室温10min，甩去多余液体，不洗6．滴加一抗（1:300 ）4℃过夜。

PBS（PH7.2~7.6）洗2min，共洗三次。

7．滴加生物素化的山羊抗兔IgG（1:100 ），37℃30min。

PBS （PH7.2~7.6 ）洗2min，共洗3 次。

8．滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素（1:100 ）PB（S PH7.2~7.6）洗5min，共 4 次。

9．DAB显色：使用DAB显色试剂盒(AR1022)。

取1ml 蒸馏水，加设计盒中A,B,C 试剂各 1 滴，混匀后加至切片。

室温显色，镜下控制反应时间，一般5~30min 之间，蒸馏水洗涤。

10．苏木素轻度复染2min，脱水，透明，封片，显微镜观察。