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免疫组化染色过程降低染色背景的步骤1.引言免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于检测组织标本中目标蛋白的表达情况。
然而，在进行免疫组化染色时，常常会遇到染色背景过高的问题，这会影响结果的准确性和可靠性。
因此，降低染色背景是很重要的。
本文将介绍一些操作步骤，帮助您降低免疫组化染色的背景。
2.材料和方法2.1样本制备首先，收集您所需的组织标本，并进行固定和包埋等常规处理，以保持标本的完整性和结构。
确保样本处理过程中的所有试剂和材料都是高质量的，以减少可能的背景干扰。
2.2抗体选择选择高特异性和高亲和力的一抗和二抗，以确保染色结果的准确性和强度。
在选择抗体时，可以参考之前的文献报道或与专家进行咨询。
此外，购买商业化的优质抗体也是一个不错的选择。
2.3样本预处理在进行免疫组化染色前，可以对样本进行预处理，以减少非特异性背景信号。
预处理的方法包括热处理、酶解等。
具体的预处理方法应根据样本的特性和需要进行优化。
2.4去除内源过氧化物酶活性内源过氧化物酶（en d og en ou sp er ox ida s e）是造成染色背景的一个常见原因。
为了减少内源过氧化物酶的活性，可以使用过氧化氢和二甲基亚砜（D MS O）的混合液对样本进行预处理。
该预处理步骤通常在抗原修复之后进行。
2.5阻断非特异性结合位点在进行染色前，应对样本进行阻断处理，以减少非特异性结合位点的背景信号。
常用的阻断方法包括使用蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白）、小鼠免疫球蛋白等。
根据具体实验需求，选择适当的阻断剂，并在充分搅拌的条件下进行阻断。
2.6优化孵育时间和温度在进行一抗和二抗的孵育过程中，合理地优化孵育时间和温度可以减少染色背景并提高检测信号。
孵育时间一般在1至2小时之间，而温度则可以根据抗体的推荐条件进行设置。
2.7染色反应时间控制染色反应的时间控制也是降低染色背景的重要步骤之一。
根据染色试剂的说明书，控制染色反应的时间，避免染色剂过多或反应时间过长导致背景增加。
免疫荧光非特异性染色的消除方法免疫荧光非特异性染色是在进行免疫荧光染色实验时常常出现的一种问题。
它指的是在一些情况下，由于实验操作不当或试剂配制不当等原因，导致荧光信号出现在与目标分子无关的细胞或组织区域上。
这种非特异性染色会严重影响实验结果的准确性和可解释性。
因此，为了得到可靠和准确的免疫荧光染色结果，研究人员需要采取措施来消除免疫荧光非特异性染色。
以下是一些常用的消除免疫荧光非特异性染色的方法：1.优化抗体浓度和孵育时间：非特异性染色常常与抗体过多或过长的孵育时间有关。
因此，在进行免疫染色实验前，应该对抗体的浓度和孵育时间进行严格的优化。
一般来说，应该根据厂家提供的建议，进行初步的实验，然后根据实验结果调整抗体浓度和孵育时间。
2.阻断非特异性结合位点：有些细胞或组织可能存在一定程度的非特异性结合位点，导致非特异性染色。
在这种情况下，可以使用特异性抗体前处理样本，以阻断非特异性结合位点。
常用的前处理方法包括用1%牛血清白蛋白（BSA）或非特异性抗血清预处理样本等。
3.优化固定条件：样本处理过程中的不恰当固定条件也可能导致非特异性染色。
所以，在固定样本的时候，应该选择适当的固定剂和固定时间，并避免过度固定。
4.混合多种报告物质：对于存在非特异性染色的样本，可以尝试混合多种报告物质来进行染色，以提高特异性。
常用的报告物质包括荧光标记的二抗、荧光标记的标记物等。
5.设置适当的阴性对照：在进行免疫染色实验时，应该设置适当的阴性对照来排除非特异性染色的可能性。
阴性对照是使用与目标分子无关的抗体或未激光的样品，可以通过对比阴性对照和实验样品的染色结果来判断是否存在非特异性染色。
总之，在进行免疫荧光染色实验时，消除非特异性染色是至关重要的。
通过优化抗体浓度和孵育时间、阻断非特异性结合位点、优化固定条件、混合多种报告物质和设置适当的阴性对照等方法，可以有效地消除免疫荧光非特异性染色，从而获得准确、可靠的实验结果。
细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。
4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。
蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。
PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。
苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。
盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。
我没用淡氨水溶液。
若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
消除肝组织免疫组化中非特异性显色的探讨侯巧燕; 陈罡; 张美艳【期刊名称】《《华夏医学》》【年(卷),期】2005(018)001【摘要】目的 :初步研究加热抗原修复对内源性抗生物素蛋白结合物 (EABA)的影响 ,探讨蛋清液在封闭肝组织 EABA、消除非特异性显色中的作用。
方法 :采用免疫组化 SP法及蛋清液封闭法 ,对甲醛固定石蜡包埋的 30例肝细胞癌组织 ,30例门脉性肝硬化组织 ,10例肝脏海绵状血管瘤之周围正常肝组织进行 EABA检查。
结果 :1经甲醛固定石蜡包埋后肝组织中的 EABA被封闭。
2加热抗原修复可造成EABA暴露。
3EABA在正常肝组织、肝硬化组织及肝癌组织中都有分布 ,主要以颗粒状形式存在于胞质中 ,造成非特异性显色。
4 2 0 %蛋清液可封闭肝组织中的EABA,消除它对正常染色的干扰。
结论 :加热修复可使甲醛固定石蜡包埋组织中的EABA重新暴露 ,暴露的 EABA见于人体正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中 ,因而对正常免疫组化染色可造成干扰 ;暴露的 EABA可被蛋清液封闭 ,以蛋清液消除肝组织中非特异性显色的方法经济便捷 ,效果良好。
【总页数】3页(P6-8)【作者】侯巧燕; 陈罡; 张美艳【作者单位】广西桂林临床病理诊断中心桂林医学院病理学教研室广西桂林541001【正文语种】中文【中图分类】R392.32; R392.33【相关文献】1.慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与肝组织病理及免疫组化关系探讨 [J], 郭西萍;冯红萍;李国军;钟基大;张继红;曹启军2.消除免疫组化非特异性染色方法研究(附60例分析) [J], 黄燕英;李燕辉;陈小岩3.快速消除胆色素在肝组织免疫组化检测中的应用 [J], 韩永;杨敏;李树林;周会芹;余琦4.免疫组化非特异性背景着色因素及其消除措施 [J], 齐新永5.乙肝血清HBVM与肝组织免疫组化关系探讨 [J], 罗光汉;周桂英;吴继周;江建宁;梁小明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
免疫组化染色质量控制标准作业指导书免疫细胞学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，它是在免疫学理论基础上利用抗原与抗体的特异性反应，在细胞或组织中定位抗原或抗体。
免疫组化技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。
随着免疫组织化学技术在临床病理研究与诊断中的广泛应用，因其反应步骤多，影响因素复杂，质量控制已被越来越多的病理技术专家重视。
20xx年全国病理学技术进展和应用研讨会上提出将质控应用到免疫组化技术上。
本文对免疫组化技术的标准化质控进行了探索，现介绍如下。
1、标本的固定为了更好地保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，必须对标本进行固定。
标本固定的好坏是影响病理诊断的关键，同样也影响免疫组化的结果，所以固定是质控的首要也是关键步骤。
影响标本固定主要因素有以下几点。
①标本离体后固定不及时：一般离体标本要求15min内必须固定，最好是在手术室由专业的护士将离体的标本用清水冲洗干净后立即放入质量浓度40g/L中性甲醛内，固定液的用量为标本体积的5～10倍。
而目前本院手术室做不到这一点，这就要求病理技术员在接到标本后要及时固定，不能延误时间。
但是在手术室和路上延误的时间不能控制。
因此，呼吁临床医生应和病理科联合起来，将标本固定地点放在手术室，以使标本及时固定，减少因固定不及时而出现的诊断困难。
②标本固定的时间：40g/L中性甲醛渗透速度一般是2mm/h，随着时间延长速度会逐渐减慢，增加浓度反而会降低渗透速度。
一般手术标本用40g/L 中性甲醛固定的时间以12～24h为佳，最长不要超过72h；如穿刺标本可用AFF液固定2～4h。
有研究显示，用40g/L中性甲醛固定1周后的标本，其组织抗原几乎不能被检出[1]。
但是，日常工作中常常会遇到有人催发病理报告的情况，他们希望病理科的报告最好像检验科那样早晨送下午就能拿到。
这种情况下只有缩短制片程序，包括固定时间，这种操作只会增加病理诊断的风险，埋下误诊的隐患。
免疫组化染色一、固定在12孔板中先用PBS洗两遍，把培养液洗掉，然后加入4%的多聚甲醛（PFA）10min（室温），再用PBS洗3次，每次间隔5 min。
二、破膜将玻片夹到封口膜上（在封口膜上滴加PBS），0.05% Triton PBS 破膜2 min（室温条件下），PBS洗3次，每次间隔5 min。
注释：第一步和第二步可以合并，具体操作如下固定和破膜1、在12孔板中加入4%的多聚甲醛（PFA），轻柔摇匀使其铺满孔板后将玻片加到孔板中，37℃，20~30 min。
2、将玻片夹到封口膜上（在封口膜上滴加PBS），0.1 % Triton PBS （浓度最高不超过0.3 %）破膜2 min，PBS洗3次，每次间隔5 min（清洗时应该沿孔壁清洗不要接触玻片，否则其表面的细胞会被清洗掉）。
三、封闭用二抗来源的10% 的血清封闭，室温封闭1 h。
封闭缓冲液（20mL）10 % NGS （山羊血清Normal Goat Serum）0.05 % Tween 20 （10 % Tween 20 100uL）1×PBS 加至20mL注释：如果时间来不及可放置在4°中过夜。
四、一抗用5% 的血清配一抗（血清也是二抗来源的），一抗浓度根据说明书。
4℃过夜，每个玻片150ul。
PBS洗6次，每次间隔5 min。
或者用5% 的血清配一抗（血清也是二抗来源的），一抗浓度根据说明书。
将封闭缓冲液吸掉，加入PBS，轻柔摇匀使其铺满孔板。
将一抗先滴加在封口膜上，用镊子夹起玻片，在纸上吸掉水。
将没有细胞的面擦干，然后将有细胞的面慢慢盖在一抗上，室温放置2~3 h。
五、二抗用1:500 （PBS），每个玻片150ul，避光1 h。
PBS洗6次，每次间隔5 min。
加二抗的方法同上六、封片10ul 封片液先滴在载玻片上，尽量不要产生气泡，用镊子夹起玻片，在纸上吸掉水。
将没有细胞的面擦干，然后将有细胞的面慢慢盖在封片剂上，注意封片剂容易凝固。
免疫组化非特异性染色太深怎么办？本人从事免疫组化实验做了好多年了，刚开始做这方面实验，出现了不少问题，最让人头疼的就是非特异性背景染色问题。
经过多年的摸索和亲身实验，摸索出问题的症结所在，针对免疫组化中存在最常见的非特异性背景染色问题，给予一些本人的见解和经验总结，希望对做科研的工作者们一些帮助和指导，也希望各位专业人士能给予批评指正。
当然这些经验总结和问题的，离不开丁香园、小木虫、中华病理网以及舜百公司专业病理人员的指导和帮助，是这些网站以及专业公司的帮助下，让我受益颇多。
免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。
组织的非特异性染色的机理很复杂,所以控制非特异性背景染色也不容易,现简单介绍一下：一、非特异性染色的识别：常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。
表现为弥漫性，均匀性的背景染色。
也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。
二、非特异性染色的原因及避免方法：1. 静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清封闭组织上的带电荷基团，从而除去与第一抗体的非特异性结合。
此法为最有效的方法。
如果还不可以的话可能蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
2.内源性过氧化物酶红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。
石蜡切片3%双氧水-甲醇溶液处理切片；3. 洗涤不彻底保证各步骤的PBS或TBS冲洗的时间和量，方法要得当，最好可以把切片放在装满洗液的染色盒内浸泡一段时间以确保充分清洗。
有一些人鉴于实验经费紧张，那吸管滴加标本上冲洗，这样很难保证冲洗的干净与否。
这实际是千里之堤，溃于蚁穴。
4. DAB显色反应时间过长最好是在显微镜下时时观察一避免显色回见过长而引起的非特异性染色背景5.一抗稀释液，可以在一抗稀释液内适当添加1%BSA或合适浓度的二抗来源的血清。
免疫荧光非特异性染色的消除方法免疫荧光染色是一种常用的方法，用于检测和定量分析细胞或组织中的特定蛋白质或其他分子。
然而，在进行免疫荧光染色时，可能会出现非特异性染色的问题，即染色结果显示的信号不仅出现在目标结构上，还出现在其他非目标结构上。
这种非特异性染色不仅会影响结果的准确性和可靠性，还会增加解释数据的困难程度。
因此，消除非特异性染色是进行免疫荧光染色时非常重要的问题之一在免疫荧光染色中，非特异性染色通常是由于两个主要因素导致的：非特异性结合和背景信号。
首先，非特异性结合是指抗体在非目标结构上出现的结合。
这可能是由于抗体的高亲和力或低选择性所致。
为了减少非特异性结合，可以采取以下几种方法：1.直接比较不同供应商的抗体根据个人实验室的具体需求，尝试不同供应商的抗体，并选择亲和力高、选择性好的抗体进行实验。
2.优化抗体的工作浓度和孵育时间降低抗体的浓度，孵育时间，或者使用浓度较低的抗体，可以减少非特异性结合。
3.使用相应的阴性对照组在每一次实验中，保留一个只有二级抗体的阴性对照组，以用于排除非特异结合引起的信号。
其次，背景信号主要由于试剂和样品中存在的非特异性荧光引起。
以下是几个可以采取的方法来降低背景信号：1.优化荧光标记物的浓度和孵育时间使用合适的荧光标记物，并对其浓度和孵育时间进行优化。
一般来说，信号的增强可以通过增加荧光标记物的浓度和/或延长孵育时间来实现，但合理的优化要使背景信号降到最低。
2.使用荧光抑制剂荧光染料抑制剂可以用于减少背景信号。
选择合适的抑制剂，并按照厂家提供的建议浓度进行使用。
3.避免非特异性荧光基质尽量避免使用荧光基质，如组织石蜡切片。
选择非荧光或低自动荧光的材料。
此外，以下是一些通用的建议1.确保良好的样品固定和处理使用适当的固定方法和缓冲液对样品进行固定和处理，以确保目标结构能够保持其形态和结构。
2.优化孵育条件通过优化温度、湿度和孵育时间等孵育条件，可以帮助提高染色的特异性和信号/背景比。
免疫组化非特异性染色的消除方法一、非特异性染色的主要因素组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。
二、消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：（一）动物脏器粉末吸收法常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。
每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。
吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。
染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。
如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
（二）透析法荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/pH7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。
加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。
加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。
洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。
最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml 荧光抗体。
（四）DEAE纤维素柱层析法标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。
方法如下：DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。
装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜。
常用梯度洗脱法如下：（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脱部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脱部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脱部分3。
将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脱液280nm 光密度高峰管合并，浓缩保存备用。
因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。
其他两部分可以废弃。
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至2.0mol/L洗脱完。
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
（五）荧光抗体稀释法先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
（六）纯化抗原法用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。
近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。
（七）纯化抗体法---免疫吸收法例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。
如分泌型IgA（SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。
方法如下：1．人IgG聚合物的制备在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。
2．免疫吸收法将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。
如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。
伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以和然释荧光抗体。
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。
一、非特异性染色的识别常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。
表现为弥漫性，均匀性的背景染色。
也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。
二、非特异性染色的原因1. Ig与Fc受体结合多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。
由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。
避免方法：①用以二抗相同种族的正常血清封闭切片；②用不含Fc段的抗体，但价格贵（V区，C1区不含Fc段，用Pepsin消化）2．静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。
避免方法：①尽量稀释一抗②降低抗体的电荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS；③用去垢剂如triton-100处理切片。
Tween-20等；3.二抗与组织中的Ig结合如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越明显，如人与猴，兔与豚鼠。
避免方法：用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。
如人血清。
4．组织中残存醛基与Ig的结合如醛类固定后未能彻底的冲洗，残流醛基可以和Ig结合。
避免方法：①彻底冲洗；②0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗；5．内源性过氧化物酶红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。
避免方法：①石蜡切片0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片；②冰冻切片3%双氧水处理切片5分钟（99：1）因为未经固定包埋，大部分酶未被破坏；③对于骨髓涂片最好用非过氧化物酶标记的抗体如碱性磷酸酶（AP）↓磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料↓快兰(fast blue)或快红(fast red)↓↓兰色红色用明胶甘油封片，不能用含二甲苯的封片剂，溶于二甲苯。
6. 内源性生物素以24mg/ml的卵白素封片15分钟；7. 交叉反应PcAb敏感性高，但特异性稍低，容易出现非特异性染色。
避免方法：①尽可能稀释抗体；②尽可能用McAb;三、抗体最大稀释度的求法最大稀释度的目的：1.节约、2.特异性染色↑、非特异性染色↓（决定其最大稀释度）棋盘法如稀释度1：50 1；100 1：150 1；200特异性染色+++ ++ ++ +非特异性染色++ + - -。
