免疫组化非特异性背景染色及其控制方法

免疫组化非特异性背景染色及其控制方法一、非特异性染色的识别常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。

表现为弥漫性，均匀性的背景染色。

也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。

二、非特异性染色的原因1. Ig与Fc受体结合多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。

由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。

避免方法：①用以二抗相同种族的正常血清封闭切片；②用不含Fc段的抗体，但价格贵（V区，C1区不含Fc段，用Pepsin消化）2．静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。

避免方法：①尽量稀释一抗②降低抗体的电荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS；③用去垢剂如triton-100处理切片。

Tween-20等；3.二抗与组织中的Ig结合如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越明显，如人与猴，兔与豚鼠。

避免方法：用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。

如人血清。

4．组织中残存醛基与Ig的结合如醛类固定后未能彻底的冲洗，残流醛基可以和Ig结合。

避免方法：①彻底冲洗；②0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗；5．内源性过氧化物酶红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。

避免方法：①石蜡切片0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片；②冰冻切片3%双氧水处理切片5分钟（99：1）因为未经固定包埋，大部分酶未被破坏；③对于骨髓涂片最好用非过氧化物酶标记的抗体如碱性磷酸酶（AP）↓磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料↓快兰(fast blue)或快红(fast red)↓ ↓兰色红色用明胶甘油封片，不能用含二甲苯的封片剂，溶于二甲苯。

6. 内源性生物素以24mg/ml的卵白素封片15分钟；7. 交叉反应PcAb敏感性高，但特异性稍低，容易出现非特异性染色。

免疫组化染色过程降低染色背景的步骤1.引言免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于检测组织标本中目标蛋白的表达情况。

然而，在进行免疫组化染色时，常常会遇到染色背景过高的问题，这会影响结果的准确性和可靠性。

因此，降低染色背景是很重要的。

本文将介绍一些操作步骤，帮助您降低免疫组化染色的背景。

2.材料和方法2.1样本制备首先，收集您所需的组织标本，并进行固定和包埋等常规处理，以保持标本的完整性和结构。

确保样本处理过程中的所有试剂和材料都是高质量的，以减少可能的背景干扰。

2.2抗体选择选择高特异性和高亲和力的一抗和二抗，以确保染色结果的准确性和强度。

在选择抗体时，可以参考之前的文献报道或与专家进行咨询。

此外，购买商业化的优质抗体也是一个不错的选择。

2.3样本预处理在进行免疫组化染色前，可以对样本进行预处理，以减少非特异性背景信号。

预处理的方法包括热处理、酶解等。

具体的预处理方法应根据样本的特性和需要进行优化。

2.4去除内源过氧化物酶活性内源过氧化物酶（en d og en ou sp er ox ida s e）是造成染色背景的一个常见原因。

为了减少内源过氧化物酶的活性，可以使用过氧化氢和二甲基亚砜（D MS O）的混合液对样本进行预处理。

该预处理步骤通常在抗原修复之后进行。

2.5阻断非特异性结合位点在进行染色前，应对样本进行阻断处理，以减少非特异性结合位点的背景信号。

常用的阻断方法包括使用蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白）、小鼠免疫球蛋白等。

根据具体实验需求，选择适当的阻断剂，并在充分搅拌的条件下进行阻断。

2.6优化孵育时间和温度在进行一抗和二抗的孵育过程中，合理地优化孵育时间和温度可以减少染色背景并提高检测信号。

孵育时间一般在1至2小时之间，而温度则可以根据抗体的推荐条件进行设置。

2.7染色反应时间控制染色反应的时间控制也是降低染色背景的重要步骤之一。

根据染色试剂的说明书，控制染色反应的时间，避免染色剂过多或反应时间过长导致背景增加。

免疫组化染色质量控制标准作业指导书免疫细胞学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，它是在免疫学理论基础上利用抗原与抗体的特异性反应，在细胞或组织中定位抗原或抗体。

免疫组化技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。

随着免疫组织化学技术在临床病理研究与诊断中的广泛应用，因其反应步骤多，影响因素复杂，质量控制已被越来越多的病理技术专家重视。

20xx年全国病理学技术进展和应用研讨会上提出将质控应用到免疫组化技术上。

本文对免疫组化技术的标准化质控进行了探索，现介绍如下。

1、标本的固定为了更好地保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，必须对标本进行固定。

标本固定的好坏是影响病理诊断的关键，同样也影响免疫组化的结果，所以固定是质控的首要也是关键步骤。

影响标本固定主要因素有以下几点。

①标本离体后固定不及时：一般离体标本要求15min内必须固定，最好是在手术室由专业的护士将离体的标本用清水冲洗干净后立即放入质量浓度40g/L中性甲醛内，固定液的用量为标本体积的5～10倍。

而目前本院手术室做不到这一点，这就要求病理技术员在接到标本后要及时固定，不能延误时间。

但是在手术室和路上延误的时间不能控制。

因此，呼吁临床医生应和病理科联合起来，将标本固定地点放在手术室，以使标本及时固定，减少因固定不及时而出现的诊断困难。

②标本固定的时间：40g/L中性甲醛渗透速度一般是2mm/h，随着时间延长速度会逐渐减慢，增加浓度反而会降低渗透速度。

一般手术标本用40g/L 中性甲醛固定的时间以12～24h为佳，最长不要超过72h；如穿刺标本可用AFF液固定2～4h。

有研究显示，用40g/L中性甲醛固定1周后的标本，其组织抗原几乎不能被检出[1]。

但是，日常工作中常常会遇到有人催发病理报告的情况，他们希望病理科的报告最好像检验科那样早晨送下午就能拿到。

这种情况下只有缩短制片程序，包括固定时间，这种操作只会增加病理诊断的风险，埋下误诊的隐患。

免疫组化操作步骤一免疫组化（ LP 法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。

如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。

如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。

）6. 缓冲液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。

（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 5min/2 次。

9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。

10 ．缓冲液洗 5min/2 次。

11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。

（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。

）12 ．缓冲液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。

（具体时间由染色深浅决定。

）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。

二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。

（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。

蛋白实验技术——免疫组化实验步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。

2. 水浴锅。

（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。

2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB，ph6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。

4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至ph8.0，加水1000ml。

5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。

b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制。

8．TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。

（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复：在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。

免疫组化非特异性染色太深怎么办？本人从事免疫组化实验做了好多年了，刚开始做这方面实验，出现了不少问题，最让人头疼的就是非特异性背景染色问题。

经过多年的摸索和亲身实验，摸索出问题的症结所在，针对免疫组化中存在最常见的非特异性背景染色问题，给予一些本人的见解和经验总结，希望对做科研的工作者们一些帮助和指导，也希望各位专业人士能给予批评指正。

当然这些经验总结和问题的，离不开丁香园、小木虫、中华病理网以及舜百公司专业病理人员的指导和帮助，是这些网站以及专业公司的帮助下，让我受益颇多。

免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。

组织的非特异性染色的机理很复杂,所以控制非特异性背景染色也不容易,现简单介绍一下：一、非特异性染色的识别：常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。

表现为弥漫性，均匀性的背景染色。

也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。

二、非特异性染色的原因及避免方法：1. 静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清封闭组织上的带电荷基团，从而除去与第一抗体的非特异性结合。

此法为最有效的方法。

如果还不可以的话可能蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

2.内源性过氧化物酶红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。

石蜡切片3%双氧水-甲醇溶液处理切片；3. 洗涤不彻底保证各步骤的PBS或TBS冲洗的时间和量，方法要得当，最好可以把切片放在装满洗液的染色盒内浸泡一段时间以确保充分清洗。

有一些人鉴于实验经费紧张，那吸管滴加标本上冲洗，这样很难保证冲洗的干净与否。

这实际是千里之堤，溃于蚁穴。

4. DAB显色反应时间过长最好是在显微镜下时时观察一避免显色回见过长而引起的非特异性染色背景5.一抗稀释液，可以在一抗稀释液内适当添加1%BSA或合适浓度的二抗来源的血清。

非特异性染色的消除方法（免疫荧光和免疫组化）-丁香园免疫荧光非特异性染色的消除方法（一）非特异性染色的主要因素组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分以下几点：1．一部分荧光素未与抗体结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去引起非特异性染色。

2．抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异结合。

3．除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原(如Forssman氏抗原)，可与组织中特异性抗原以外的相应抗原结合。

4．从组织中难以提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。

5．抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。

6．荧光素不纯，标本固定不当等。

（二）消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：1．透析法荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。

（1）将标记完毕的荧光抗体液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。

（2）浸人0.01mol／L pH7.2的PBS中(悬于大于标记物体积约50—100倍的PBS内)，在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，透析液中无荧光即可(在荧光光源照射下)。

2．葡聚糖凝胶G-50柱层析法除去游离荧光素可用葡聚糖凝胶G-25或G-50柱层析方法，加入荧光抗体15～18ml(按床体积的5％～10％加样)，使其缓慢渗人柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30—40min，使游离荧光素充分进入分子筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。

加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的距离界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分，收集中间部分，测F／P比值，合格者浓缩，分装。