免疫组化非特异性染色消除方法

免疫荧光非特异性染色的消除方法免疫荧光非特异性染色是在进行免疫荧光染色实验时常常出现的一种问题。

它指的是在一些情况下，由于实验操作不当或试剂配制不当等原因，导致荧光信号出现在与目标分子无关的细胞或组织区域上。

这种非特异性染色会严重影响实验结果的准确性和可解释性。

因此，为了得到可靠和准确的免疫荧光染色结果，研究人员需要采取措施来消除免疫荧光非特异性染色。

以下是一些常用的消除免疫荧光非特异性染色的方法：1.优化抗体浓度和孵育时间：非特异性染色常常与抗体过多或过长的孵育时间有关。

因此，在进行免疫染色实验前，应该对抗体的浓度和孵育时间进行严格的优化。

一般来说，应该根据厂家提供的建议，进行初步的实验，然后根据实验结果调整抗体浓度和孵育时间。

2.阻断非特异性结合位点：有些细胞或组织可能存在一定程度的非特异性结合位点，导致非特异性染色。

在这种情况下，可以使用特异性抗体前处理样本，以阻断非特异性结合位点。

常用的前处理方法包括用1%牛血清白蛋白（BSA）或非特异性抗血清预处理样本等。

3.优化固定条件：样本处理过程中的不恰当固定条件也可能导致非特异性染色。

所以，在固定样本的时候，应该选择适当的固定剂和固定时间，并避免过度固定。

4.混合多种报告物质：对于存在非特异性染色的样本，可以尝试混合多种报告物质来进行染色，以提高特异性。

常用的报告物质包括荧光标记的二抗、荧光标记的标记物等。

5.设置适当的阴性对照：在进行免疫染色实验时，应该设置适当的阴性对照来排除非特异性染色的可能性。

阴性对照是使用与目标分子无关的抗体或未激光的样品，可以通过对比阴性对照和实验样品的染色结果来判断是否存在非特异性染色。

总之，在进行免疫荧光染色实验时，消除非特异性染色是至关重要的。

通过优化抗体浓度和孵育时间、阻断非特异性结合位点、优化固定条件、混合多种报告物质和设置适当的阴性对照等方法，可以有效地消除免疫荧光非特异性染色，从而获得准确、可靠的实验结果。

消除肝组织免疫组化中非特异性显色的探讨侯巧燕; 陈罡; 张美艳【期刊名称】《《华夏医学》》【年(卷),期】2005(018)001【摘要】目的 :初步研究加热抗原修复对内源性抗生物素蛋白结合物 (EABA)的影响 ,探讨蛋清液在封闭肝组织 EABA、消除非特异性显色中的作用。

方法 :采用免疫组化 SP法及蛋清液封闭法 ,对甲醛固定石蜡包埋的 30例肝细胞癌组织 ,30例门脉性肝硬化组织 ,10例肝脏海绵状血管瘤之周围正常肝组织进行 EABA检查。

结果 :1经甲醛固定石蜡包埋后肝组织中的 EABA被封闭。

2加热抗原修复可造成EABA暴露。

3EABA在正常肝组织、肝硬化组织及肝癌组织中都有分布 ,主要以颗粒状形式存在于胞质中 ,造成非特异性显色。

4 2 0 %蛋清液可封闭肝组织中的EABA,消除它对正常染色的干扰。

结论 :加热修复可使甲醛固定石蜡包埋组织中的EABA重新暴露 ,暴露的 EABA见于人体正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中 ,因而对正常免疫组化染色可造成干扰 ;暴露的 EABA可被蛋清液封闭 ,以蛋清液消除肝组织中非特异性显色的方法经济便捷 ,效果良好。

【总页数】3页(P6-8)【作者】侯巧燕; 陈罡; 张美艳【作者单位】广西桂林临床病理诊断中心桂林医学院病理学教研室广西桂林541001【正文语种】中文【中图分类】R392.32; R392.33【相关文献】1.慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与肝组织病理及免疫组化关系探讨 [J], 郭西萍;冯红萍;李国军;钟基大;张继红;曹启军2.消除免疫组化非特异性染色方法研究(附60例分析) [J], 黄燕英;李燕辉;陈小岩3.快速消除胆色素在肝组织免疫组化检测中的应用 [J], 韩永;杨敏;李树林;周会芹;余琦4.免疫组化非特异性背景着色因素及其消除措施 [J], 齐新永5.乙肝血清HBVM与肝组织免疫组化关系探讨 [J], 罗光汉;周桂英;吴继周;江建宁;梁小明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。

经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。

该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。

随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。

但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。

本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。

1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。

排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。

可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。

解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。

如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。

如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。

1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。

解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。

免疫组化常见问题及解决方法 生物谷网站当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。

对照/标本无染色①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。

③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。

比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。

④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。

⑥检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。

⑦检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。

需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。

⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。

⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。

弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。

②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。

一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

免疫组化非特异性染色太深怎么办？本人从事免疫组化实验做了好多年了，刚开始做这方面实验，出现了不少问题，最让人头疼的就是非特异性背景染色问题。

经过多年的摸索和亲身实验，摸索出问题的症结所在，针对免疫组化中存在最常见的非特异性背景染色问题，给予一些本人的见解和经验总结，希望对做科研的工作者们一些帮助和指导，也希望各位专业人士能给予批评指正。

当然这些经验总结和问题的，离不开丁香园、小木虫、中华病理网以及舜百公司专业病理人员的指导和帮助，是这些网站以及专业公司的帮助下，让我受益颇多。

免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。

组织的非特异性染色的机理很复杂,所以控制非特异性背景染色也不容易,现简单介绍一下：一、非特异性染色的识别：常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。

表现为弥漫性，均匀性的背景染色。

也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。

二、非特异性染色的原因及避免方法：1. 静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清封闭组织上的带电荷基团，从而除去与第一抗体的非特异性结合。

此法为最有效的方法。

如果还不可以的话可能蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

2.内源性过氧化物酶红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。

石蜡切片3%双氧水-甲醇溶液处理切片；3. 洗涤不彻底保证各步骤的PBS或TBS冲洗的时间和量，方法要得当，最好可以把切片放在装满洗液的染色盒内浸泡一段时间以确保充分清洗。

有一些人鉴于实验经费紧张，那吸管滴加标本上冲洗，这样很难保证冲洗的干净与否。

这实际是千里之堤，溃于蚁穴。

4. DAB显色反应时间过长最好是在显微镜下时时观察一避免显色回见过长而引起的非特异性染色背景5.一抗稀释液，可以在一抗稀释液内适当添加1%BSA或合适浓度的二抗来源的血清。

免疫荧光非特异性染色的消除方法一、非特异性染色的主要因素组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。

（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。

（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。

（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。

（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。

（6）荧光素不纯，标本固定不当等。

二、消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：（一）动物脏器粉末吸收法常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。

每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。

吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。

染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。

肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。

如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。

用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。

免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及其对策良好的免疫组化染色切片是正确推断染色结果的基础和前提。

由于免疫组化染色过程中存在许多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件特别简单的事。

需要病理技术员和病理医生亲密协作、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。

虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和"杂音'染色片（有阳性信号）。

一、无色片染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。

这是常规工作中比较常见的现象，消失这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有消失问题，组织或细胞的确不表达与抗体相关的抗原。

2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。

假阴性结果又可分为两种状况：（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。

消失这种状况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。

获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。

由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不行缺少的作用。

（2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。

比如，组织未进行抗原修复，有的组织必需经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个渐渐的过，但间或也遇到突然失效的状况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的缘由。

也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如遗忘加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。

为了避开这种简洁的错误，有一种简洁的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观看是否消失棕色。

假如消失了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。

假如这种DAB再滴到切片上没有消失任何阳性信号，问题肯定是出在三抗以前。

免疫荧光非特异性染色的消除方法免疫荧光染色是一种常用的方法，用于检测和定量分析细胞或组织中的特定蛋白质或其他分子。

然而，在进行免疫荧光染色时，可能会出现非特异性染色的问题，即染色结果显示的信号不仅出现在目标结构上，还出现在其他非目标结构上。

这种非特异性染色不仅会影响结果的准确性和可靠性，还会增加解释数据的困难程度。

因此，消除非特异性染色是进行免疫荧光染色时非常重要的问题之一在免疫荧光染色中，非特异性染色通常是由于两个主要因素导致的：非特异性结合和背景信号。

首先，非特异性结合是指抗体在非目标结构上出现的结合。

这可能是由于抗体的高亲和力或低选择性所致。

为了减少非特异性结合，可以采取以下几种方法：1.直接比较不同供应商的抗体根据个人实验室的具体需求，尝试不同供应商的抗体，并选择亲和力高、选择性好的抗体进行实验。

2.优化抗体的工作浓度和孵育时间降低抗体的浓度，孵育时间，或者使用浓度较低的抗体，可以减少非特异性结合。

3.使用相应的阴性对照组在每一次实验中，保留一个只有二级抗体的阴性对照组，以用于排除非特异结合引起的信号。

其次，背景信号主要由于试剂和样品中存在的非特异性荧光引起。

以下是几个可以采取的方法来降低背景信号：1.优化荧光标记物的浓度和孵育时间使用合适的荧光标记物，并对其浓度和孵育时间进行优化。

一般来说，信号的增强可以通过增加荧光标记物的浓度和/或延长孵育时间来实现，但合理的优化要使背景信号降到最低。

2.使用荧光抑制剂荧光染料抑制剂可以用于减少背景信号。

选择合适的抑制剂，并按照厂家提供的建议浓度进行使用。

3.避免非特异性荧光基质尽量避免使用荧光基质，如组织石蜡切片。

选择非荧光或低自动荧光的材料。

此外，以下是一些通用的建议1.确保良好的样品固定和处理使用适当的固定方法和缓冲液对样品进行固定和处理，以确保目标结构能够保持其形态和结构。

2.优化孵育条件通过优化温度、湿度和孵育时间等孵育条件，可以帮助提高染色的特异性和信号/背景比。