SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量.

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 ．掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。

2 ．熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。

【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。

不同蛋白质分子具有不同的大小、形状，在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量，因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同，二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动，经过一定的时间后得以分离，这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。

聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。

在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关，为了使其只与蛋白质分子的大小有关，从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量，就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。

SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质），使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。

SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? ，即 1.8 nm ），而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。

说明， SDS 和蛋白质的结合所形成的 SDS- 蛋白质复合物消除了由于天然蛋白质形状不同而对电泳迁移率的影响。

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种蛋白质分析方法，常用于测定蛋白质的相对分子量。

其原理是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电，使蛋白质在凝胶中按照相对分子量大小进行分离。

具体原理如下：
1. SDS：SDS是一种表面活性剂，它可以与蛋白质发生结合，使得所有蛋白质带有相同的电荷密度。

2. 蛋白质解不性：在SDS存在条件下，蛋白质发生解性，其中SDS会形成不溶解的复合物，使蛋白质具有均一负电荷。

3. 凝胶电泳：将SDS处理后的蛋白质样品加于聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上，施加电场使蛋白质迁移。

4. 分离：由于凝胶电泳胶阻力不同，蛋白质经过一段时间后在凝胶上分离成锥形区带。

5. 相对分子量测定：在同一凝胶中，已知相对分子量已知的标准蛋白质样品与待测蛋白质样品进行分析，通过对比标准蛋白质样品的迁移距离和待测蛋白质样品的迁移距离，可以推算出待测蛋白质样品的相对分子量。

需要注意的是，由于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是以相对分子量进行分析的，所以对于蛋白质的准确分子量测定，还需结合其他方法如质谱等进行综合分析。

实验四 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量姓名：mangogolaSDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理是：蛋白质在电泳中的迁移速率取决于其所带电荷、分子大小以及形状等因素，而大多数蛋白质与SDS 按一定比例结合（1:1.4/g:g ），这样使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，而且形状为短轴相同的雪茄烟形。

由此蛋白质分子的电泳迁移率仅取决于其分子量，在特定凝胶浓度下，一定范围内的蛋白质分子量对数与迁移率呈直线关系，选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白，与样品同时电泳计算得到标准曲线，并根据待测样品的相对迁移率在标准曲线上查出其分子量。

一．实验过程1.凝胶工作液的配制2.灌制分离胶将制胶玻璃板清洗安装紧密后，插入制孔器，在距制孔器下端1cm 处做一标记，取下制孔器将分离胶溶液加入两块玻璃板之间至标记处。

然后立即用注射器向凝胶液面轻轻铺上一层厚约0.5cm 的dd 水，目的是使凝胶面平整，放置待其聚合凝固。

3.灌制浓缩胶将分离胶上的双蒸水用注射器取出并用滤纸吸干，放入制孔器，用滴管灌入浓缩胶至玻璃板顶端待其聚合凝固。

4.待测样品的制备取0.1ml 透析除盐后的样品稀释液（浓度在0.2mg/ml 左右），加入0.1ml 样品溶解液，混匀后沸水浴5min ，冷却。

（沸水浴的目的是使蛋白质变性成肽链，便于与SDS 结合，甘油可以增加蛋白质的比重，便于沉降到加样孔底部，不易飘散） 5.加样和电泳将电极缓冲液注入缓冲液槽，然后轻轻拔出制孔器，加样后连接电泳仪，记录每个加样孔的样品类型及上样量。

浓缩胶使用50V 恒压，分离胶使用100V 恒压。

浓缩胶浓度4%，交联度2.7%[Acr （30%）：Bis （0.8%）]溶液0.67ml dd 水3.05ml0.5M pH6.8 Tris-Hcl （0.4%SDS ）溶液 1.25mlTEMED （原液）6ul将以上成分加入小烧杯中轻轻摇匀，加入10%的硫代硫酸铵0.026ml ，摇匀后灌胶。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定【实验目的】1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。

2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。

【实验原理】SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。

SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。

SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。

由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。

2.实验试剂⑴ 2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。

⑵ 1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。

实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量实验数据：标准蛋白质条带第一条第二条第三条第四条第五条溴酚蓝前沿距离/cm 4.70距离/cm 0.50 0.95 1.60 2.10 3.95 相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84 分子量Mr 97400 66200 43000 31000 14400LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16样品 1 2 3溴酚蓝前沿/cm 4.90 4.80 4.60样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70相对迁移率mr 0.86 0.25 0.37标准曲线：y=5.05-1.10x结果：样品 1 2 3Mr 12706 59566 43954mr 4.104 4.775 4.643一. 实验目的和要求1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

2 掌握垂直板电泳的操作方法。

3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。

二 .实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。

支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。

区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。