SDS-PAGE测量蛋白质分子量解析

SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定一、实验目的与原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。

1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。

本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。

二、仪器与试剂1、材料：硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。

2、试剂：（1）丙稀酰胺（Acr母液）：30%Acr （Acr/Bis）（2）10%的SDS溶液（3）10%的过硫酸铵溶液（4）四甲基乙二胺（TEMED）（5）分离胶缓冲液：1.5M Tris，PH8.8（6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris，PH6.8（7）电极缓冲液：10×30g Tris，125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3（8）样品缓冲液：0.2M Tris，PH6.8，1%SDS，30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰（9）染色液：0.15%考马斯亮蓝R250，溶于脱色液（10）脱色液：50%的甲醇，7%的冰醋酸的水溶液（11）标准分子量蛋白。

3、仪器设备：电泳仪、垂直电泳槽等。

三、操作步骤1、凝胶制备：用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。

将配制好的分离胶溶液倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。

SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术学习SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术实验原理SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)：1. 在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。

2. 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS (阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。

此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

3. 蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，其电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。

实验设备与试剂垂直板型电泳槽直流稳压电源微量注射器移液器水浴锅染色槽烧杯试管滴管分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl, pH8.8)：称取Tris 18.15g，加约80ml 无离子水，用1 mol/L HCl调pH至8.8，无离子水定容至100ml，4℃保存浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L Tris-HCl液, pH6.8)：称取Tris 6g，加约60ml 无离子水，用1 mol/L HCl调pH至6.8，无离子水定容至100ml，4℃保存凝胶贮液：称取丙烯酰胺(Acr) 29.2g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，重蒸水定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中并定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存10%SDS溶液：10g SDS加重蒸水定容至100ml，室温保存(低温下易析出结晶，用前微热，使其完全溶解)1%TEMED (四甲基二乙胺)10%过硫酸铵(AP)：配制后分装，-20℃保存电泳缓冲液(Tris-Gly缓冲液pH8.3)：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454ml 50%甲醇溶液和46ml冰乙酸即可脱色液：75ml冰乙酸，875ml重蒸水与50ml甲醇混匀实验步骤1. 安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。

下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。

SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。

相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。

蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。

通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。

这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。

SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。

（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。

这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。

（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。

随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。

（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。

目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。

SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。

其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。

通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。

实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量一、目的了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。

二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。

本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。

三、试剂和器材（一）试剂1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。

2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。

18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。

3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。

6gTris,少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。

4. 10%SDS，室温保存。

5. 两类样品缓冲液：2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml甘油 2.0 ml质量浓度10%SDS 4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇 1.0 ml总体积10 ml6. 电极缓冲液，pH8.3。

Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。

1.样品溶液中各种试剂的作用是什么?SDS：使蛋白质变性剂能与样品蛋白结合，使样品蛋白质都带负电荷显棒状，消除了电荷和分子形状对相对分子质量的测定的影响，从而可利用相对分子质量差来分离蛋白。

巯基乙醇：使蛋白质中的二硫键断裂，并保持不再被氧化，使聚合的蛋白分子分解成各亚基或单链，因此最后测出的结果只是各亚基或单链的相对分子质量，而不是整个蛋白分子的相对分子质量。

甘油：是加入的样品蛋白随甘油一起沉降到样品孔底部而不至于样品漂浮在缓冲液中。

盐酸：主要起缓冲作用，保持样品蛋白的电荷量即用来调节PH。

2.本实验是否需在低温下进行?不需要在低温下进行。

低温可能会使蛋白质变性。

3.简述聚丙烯酰胺凝胶电泳测定生物分子分子量的原理，如何调节凝胶的孔径？蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。

如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。

当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。

由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。

4.SDS-凝胶电泳中TEMD的作用是什么？在样品缓冲液中加入0.1%溴酚蓝有何作用？促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固可以让蛋白下沉到点样孔底部，防止漂样，还有指示剂的作用。

5.本实验中溴酚蓝和考马氏亮蓝的作用分别是什么？可以让蛋白下沉到点样孔底部，防止漂样，作为指示剂，因为溴酚蓝呈蓝色，而蛋白质是白色，在SDS-凝胶中不明显，且溴酚蓝的相对分子量比蛋白质(绝大部分)小，电泳时速度比蛋白质稍快，因此当溴酚蓝到达电泳槽底部(可看蓝色调带)，则电泳结束。