SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。

下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。

SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。

相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。

蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。

通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。

这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。

SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。

（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。

这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。

（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。

随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。

（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。

目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。

SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。

其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。

通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。

SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。

二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。

它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。

通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。

三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。

2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。

3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。

4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。

5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。

打开电源，调整电流和电压，开始电泳。

6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。

7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。

四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。

通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。

此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。

实验教学教案首页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量（设计性）相关知识1.电泳？2.影响电泳速率的因素？3.SDS 的作用？4.β－乙醇的作用？ 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）：3.分类：自然胶电泳、变性胶电泳、等电聚焦电泳、梯度胶电泳、双向电泳、印迹转移电泳。

4.不连续缓冲系统：SDS －PAGE 电泳体系为不连续电泳体系。

5．分离胶浓度的选择和配制方法SDS *双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。

常用的标准蛋白质的Mr丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺TEMED过硫酸铵聚丙烯酰胺凝胶 ＋pH 6.8pH8.8Tris-GlyTris-Gly pH8.3不同分离胶的配制方法5%注意：根据实验目的、实验要求、实验条件在实验前写出实验设计方案一、实验目的、实验要求、实验条件实验目的1．用SDS－PAGE法测定样品中蛋白质相对分子质量；2．熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。

实验要求1.能够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作，注意几个设计点:①如标准蛋白质的选择依据；②分离胶的确定与制备：浓度大小的依据是？分离胶配制量多少的依据是？③灌胶方法的选择？④上样量的确定：依据蛋白质浓度大小确定上样量，一般是样品在含1~6种蛋白且各占比例相当的情况下浓度在1~2mg/ml时、对凝胶大小在8×8.2时，上样量为10~20ul；⑤电泳时电压控制多大的选择；⑥能够对实验过程中出现的问题加能解决，能够独立思考分析电泳结果，总结本实验成功与失败的原因。

2．利用标准曲线计算出待测蛋白质样品的Mr。

实验条件1．实验所需的实验试剂和材料。

2.实验所需的主要实验仪器。

二、实验原理带电颗粒在单位电场中泳动的速度称为迁移率或泳动度（mobility）。

泳动度与带电颗粒所带静电荷的数量、颗粒大小和形状有关。

一般来说，颗粒所带静电荷的数量越多，颗粒越小，越接近球形，则泳动度越大。

SDS即十二烷基硫酸钠（sodium dodycyl sulfate），是一种阴离子去污剂。

生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。

2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。

最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。

实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。

实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

测定蛋白质相对分子质量的方法
测定蛋白质相对分子质量的方法有多种，以下列举几种常用的方法：
1. SDS-PAGE：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质按照分子量大小分离出来。

蛋白质在胁迫条件下与SDS形成复合物，其电荷密度相对一致，所以主要根据蛋白质在凝胶中的迁移距离来估算其分子量。

2. SDS-PAGE-Western blotting：在SDS-PAGE的基础上，将分离出的蛋白质转移到聚合物膜上，并使用特异性抗体检测靶蛋白。

通过与已知分子量的标准品比较，可以推断目标蛋白质的相对分子质量。

3. 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）：该方法通过将蛋白质与基质结合后，利用激光辐射将其离子化，并通过不同质荷比（m/z）的飞行时间分析获得蛋白质的质量/电荷比。

结合已知质量的标准品，可计算得到蛋白质的分子量。

4. 高效液相色谱-多角度光散射（HPLC-MALS）：通过高效液相色谱分离蛋白质，并结合多角度光散射检测器，测量蛋白质溶液中散射光强的变化。

根据多角度光散射理论，计算出蛋白质颗粒的质量和大小分布，从而推断其相对分子质量。

需要注意的是，不同的方法可能有其适用范围和准确性上的差异，因此选择合适的方法需要根据具体实验目的和条件进行评估。

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的：通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。

二、实验原理：SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。

在该技术中，蛋白质样品与SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂混合后，加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合，形成具有负电荷的复合物。

这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。

蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶，即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散，形成连续的蛋白质稜。

然后，电泳阶段开始，电场通过凝胶，带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。

三、实验步骤：1.准备SDS-电泳胶液：根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液，即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。

2. 准备样品：取相应的蛋白质样品，如细胞裂解液，将其与试剂R （含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺）和Laemmli试剂混合，以加热破坏蛋白质的二级结构。

3.堆胶：将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中，留出足够的空间来注入分离胶液。

4.加载样品：在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。

5.电泳：将电泳槽连接到电源，调节电压，使电流保持稳定。

首先进行堆胶阶段，然后切换到电泳阶段，直至蛋白质移动到凝胶底部。

6. 凝胶染色：取下凝胶，用凝胶染色剂对凝胶进行染色。

一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。

四、实验结果：根据实验步骤描述的方法进行实验后，我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带，每条条带代表一个蛋白质。

条带的颜色越深，表示其含量越多。

通过与分子量标记的对照，可以确定蛋白质的相对分子质量。

五、实验讨论与分析：根据实验结果，我们可以推断蛋白质的相对分子质量。

相对分子质量可以通过标准曲线法来计算，即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。

通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点：能够同时分离多个蛋白质；能够对蛋白质进行集中分析；精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。

sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析技术，用于测定蛋白质的相对分子质量。

SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤：
1. 蛋白样品的准备：将待测蛋白样品与SDS（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质表面被负电荷包裹。

2. 样品加载和电泳过程：将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）中的孔洞中。

通常采用垂直电泳方式进行，将正电极和负电极连接至凝胶两端，通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。

3. 分子分离：在电泳过程中，由于SDS的存在，样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷，使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。

较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移，较大的蛋白质则移动速率较慢。

4. 染色和可视化：电泳结束后，使用染色剂（如Coomassie蓝染色剂）将蛋白质染色，使其可见。

通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以估计蛋白质的相对分子质量。

总结：SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷，在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质，通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。