SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。

下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。

SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。

相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。

蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。

通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。

这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。

SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。

（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。

这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。

（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。

随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。

（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。

目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。

SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。

其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。

通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。

SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。

二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。

它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。

通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。

三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。

2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。

3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。

4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。

5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。

打开电源，调整电流和电压，开始电泳。

6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。

7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。

四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。

通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。

此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。

实验教学教案首页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量（设计性）相关知识1.电泳？2.影响电泳速率的因素？3.SDS 的作用？4.β－乙醇的作用？ 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）：3.分类：自然胶电泳、变性胶电泳、等电聚焦电泳、梯度胶电泳、双向电泳、印迹转移电泳。

4.不连续缓冲系统：SDS －PAGE 电泳体系为不连续电泳体系。

5．分离胶浓度的选择和配制方法SDS *双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。

常用的标准蛋白质的Mr丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺TEMED过硫酸铵聚丙烯酰胺凝胶 ＋pH 6.8pH8.8Tris-GlyTris-Gly pH8.3不同分离胶的配制方法5%注意：根据实验目的、实验要求、实验条件在实验前写出实验设计方案一、实验目的、实验要求、实验条件实验目的1．用SDS－PAGE法测定样品中蛋白质相对分子质量；2．熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。

实验要求1.能够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作，注意几个设计点:①如标准蛋白质的选择依据；②分离胶的确定与制备：浓度大小的依据是？分离胶配制量多少的依据是？③灌胶方法的选择？④上样量的确定：依据蛋白质浓度大小确定上样量，一般是样品在含1~6种蛋白且各占比例相当的情况下浓度在1~2mg/ml时、对凝胶大小在8×8.2时，上样量为10~20ul；⑤电泳时电压控制多大的选择；⑥能够对实验过程中出现的问题加能解决，能够独立思考分析电泳结果，总结本实验成功与失败的原因。

2．利用标准曲线计算出待测蛋白质样品的Mr。

实验条件1．实验所需的实验试剂和材料。

2.实验所需的主要实验仪器。

二、实验原理带电颗粒在单位电场中泳动的速度称为迁移率或泳动度（mobility）。

泳动度与带电颗粒所带静电荷的数量、颗粒大小和形状有关。

一般来说，颗粒所带静电荷的数量越多，颗粒越小，越接近球形，则泳动度越大。

SDS即十二烷基硫酸钠（sodium dodycyl sulfate），是一种阴离子去污剂。

生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。

2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。

最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。

实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。

实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

测定蛋白质相对分子质量的方法
测定蛋白质相对分子质量的方法有多种，以下列举几种常用的方法：
1. SDS-PAGE：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质按照分子量大小分离出来。

蛋白质在胁迫条件下与SDS形成复合物，其电荷密度相对一致，所以主要根据蛋白质在凝胶中的迁移距离来估算其分子量。

2. SDS-PAGE-Western blotting：在SDS-PAGE的基础上，将分离出的蛋白质转移到聚合物膜上，并使用特异性抗体检测靶蛋白。

通过与已知分子量的标准品比较，可以推断目标蛋白质的相对分子质量。

3. 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）：该方法通过将蛋白质与基质结合后，利用激光辐射将其离子化，并通过不同质荷比（m/z）的飞行时间分析获得蛋白质的质量/电荷比。

结合已知质量的标准品，可计算得到蛋白质的分子量。

4. 高效液相色谱-多角度光散射（HPLC-MALS）：通过高效液相色谱分离蛋白质，并结合多角度光散射检测器，测量蛋白质溶液中散射光强的变化。

根据多角度光散射理论，计算出蛋白质颗粒的质量和大小分布，从而推断其相对分子质量。

需要注意的是，不同的方法可能有其适用范围和准确性上的差异，因此选择合适的方法需要根据具体实验目的和条件进行评估。

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的：通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。

二、实验原理：SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。

在该技术中，蛋白质样品与SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂混合后，加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合，形成具有负电荷的复合物。

这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。

蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶，即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散，形成连续的蛋白质稜。

然后，电泳阶段开始，电场通过凝胶，带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。

三、实验步骤：1.准备SDS-电泳胶液：根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液，即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。

2. 准备样品：取相应的蛋白质样品，如细胞裂解液，将其与试剂R （含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺）和Laemmli试剂混合，以加热破坏蛋白质的二级结构。

3.堆胶：将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中，留出足够的空间来注入分离胶液。

4.加载样品：在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。

5.电泳：将电泳槽连接到电源，调节电压，使电流保持稳定。

首先进行堆胶阶段，然后切换到电泳阶段，直至蛋白质移动到凝胶底部。

6. 凝胶染色：取下凝胶，用凝胶染色剂对凝胶进行染色。

一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。

四、实验结果：根据实验步骤描述的方法进行实验后，我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带，每条条带代表一个蛋白质。

条带的颜色越深，表示其含量越多。

通过与分子量标记的对照，可以确定蛋白质的相对分子质量。

五、实验讨论与分析：根据实验结果，我们可以推断蛋白质的相对分子质量。

相对分子质量可以通过标准曲线法来计算，即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。

通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点：能够同时分离多个蛋白质；能够对蛋白质进行集中分析；精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。

sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析技术，用于测定蛋白质的相对分子质量。

SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤：
1. 蛋白样品的准备：将待测蛋白样品与SDS（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质表面被负电荷包裹。

2. 样品加载和电泳过程：将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）中的孔洞中。

通常采用垂直电泳方式进行，将正电极和负电极连接至凝胶两端，通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。

3. 分子分离：在电泳过程中，由于SDS的存在，样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷，使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。

较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移，较大的蛋白质则移动速率较慢。

4. 染色和可视化：电泳结束后，使用染色剂（如Coomassie蓝染色剂）将蛋白质染色，使其可见。

通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以估计蛋白质的相对分子质量。

总结：SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷，在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质，通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。

蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。

2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。

SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。

SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。

由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。

引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。

化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。

采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。

因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

三、实验器材及数据30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml四、注意事项1、acr和bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴口罩和手套，纯化应在通风处内进行。

一、实验目的：1.1理解SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的基本原理。

1.2掌握分子电泳的基本步骤，掌握计算蛋白质相对分子质量的方法。

二、实验内容和原理：2.1电泳（electrophoresis）：是指带电颗粒在电场中向着与它电性相反的电极移动的现象。

许多重要的生物分子都含有可电离基团（如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等），在非等电点条件下可解离成带有电荷分子，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。

电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。

可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。

2.2影响带电粒子在电场中泳动的因素：①生物分子的性质：待分离生物大分子所带电荷的多少、性质、分子大小和形状都会对电泳产生明显影响。

②缓冲液：缓冲液pH值直接影响生物分子的解离程度和带电性质。

溶液pH值距离等电点愈远，生物分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越快。

当缓冲液pH大于等电点时，生物分子带负电荷，电泳时向正极移动；当缓冲液pH小于等电点时，生物分子带正电荷，电泳时向负极移动。

③电场强度：电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。

一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。

但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最终导致介质温度升高。

降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间，引起生物分子扩散增加，同样影响分离效果。

所以电泳实验中要选择适当的电场强度。

④电渗：液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。

由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。

这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。

当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量实验目的了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。

学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。

实验原理SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。

1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。

2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：1gMr =K―bm R式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。

在条件一定时，b和K均为常数。

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。

未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

仪器、原料和试剂仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。

原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。

可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。

试剂：（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。

（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量数据处理（Excel教程）(免手工计算，免手工绘图，精确度高)
1.建立excel表格，并将实验数据输入
2.用f（x）=C4/4.5公式，计算出D5值，利用自动填充功能计算出
D列
3.相同方法，用LOG10（）公式计算出F列
4.按住Ctrl键，选中D列、F列，选择插入-散点图并用鼠标选中坐
标点，右击，选择添加趋势线，并显示公式(默认情况下，左列为x轴，右列为y轴)
5.用POWER()公式求得Mr
6.用单元格格式调整每一列的小数点后位数
7.打印即可
1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白溶液/ml 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 蒸馏水/ml 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 蛋白质浓度（mg/ml）0 0.125 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1.0 A280 0 0.125 0.189 0.267 0.351 0.408 0.557 0.631
2．样品蛋白质浓度测定
1)蛋白质（mg/ml）=1.167*30*100/90=38.9mg/ml
2)蛋白质（mg/ml）=1.127*30*100/90=56.35mg/ml
3)蛋白质（mg/ml）=1.167*30*100/90=110.23mg/ml
4)蛋白质（mg/ml）=1.167*30*100/90=312.4mg/ml
5)表3--SOD的分离纯化结果表。

测定蛋白质相对分子质量的方法
蛋白质相对分子质量可用以下几种常见的实验测定：
1.同位素掺入法：能准确测定蛋白质相对分子质量的一种方法，它的原理是利用质谱方法，将蛋白质样品中的氢原子替换成同位素氢，如²H 或³⁷Cl，用质谱分析同位素掺入后的蛋白质的改变，从而推算出蛋白质的相对分子质量。

2.SDS-PAGE：蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中移动的速度与分子质量有关，可用此方法推算蛋白质的相对分子质量：根据蛋白质在凝胶上移动的时间确定其相对分子质量。

3. 光波谱法：可以通过紫外拉曼光谱（UV-Raman）或者红外谱（IR），计算结合能从而计算蛋白质分子的相对分子质量。

4.质谱分析法：利用质谱技术直接测定蛋白质的大小，包括电喷雾质谱（ESI-MS）、离子化质谱（FAIMS）和质谱分析（MS）等技术。

利用质谱技术，可以测定蛋白质的相对分子质量，从而帮助我们研究蛋白质的特性和作用。