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蛋白质的定量测定方法PPT课件

蛋白质的定量测定方法PPT课件
以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘 制出标准曲线。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下 测定其光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中 查出样品溶液的蛋白质含量。
第8页/共24页
【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
蛋白质染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定 的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2 分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏 度 高 ， 稳 定 性 好 ， 是 一 种 测 定 蛋第白20质页/含共量24页的 常 用 方 法 。
【实验材料】
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升 Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值 。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量。
第5页/共24页
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白
质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最
பைடு நூலகம்
广泛的方法之一。
第2页/共24页
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于／L氢氧化钠溶液中，再把 硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后 将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。

蛋白质分子量的测定方法

蛋白质分子量的测定方法

荧光光谱法是一种利用荧光物质发出 荧光的特性进行检测的方法。在蛋白 质分子量的测定中，荧光光谱法通过 测量荧光物质与蛋白质结合前后荧光 光谱的变化，推算出蛋白质的分子量。
VS
荧光物质能够吸收特定波长的光，并 发出特定波长的荧光。当荧光物质与 蛋白质结合时，荧光光谱会发生改变， 这种改变与蛋白质的分子量有关。
根据荧光光谱的变化，利 用已知的荧光物质分子量 和蛋白质分子量之间的关 系，计算出蛋白质的分子 量。
注意事项
选择合适的荧光物质
根据蛋白质的性质选择合适的荧光物质，以 确保测量结果的准确性。
避免光漂白
在测量过程中，应避免长时间照射导致荧光 物质光漂白的现象。
控制实验条件
保持实验温度、pH值等条件的恒定，以减 小误差。
操作步骤
样品准备
将蛋白质样品进行适当处理， 如溶解、变性等，以便进行离
子化处理。
离子化处理
通过电喷雾、激光解析等手段 将蛋白质样品进行离子化。
质谱分析
将离子化的蛋白质样品引入质 谱仪中，通过电场和磁场的作 用进行分离和检测。
结果处理
对检测到的质谱数据进行处理 和分析，推算出蛋白质的分子
量。
注意事项
操作步骤
01
02
03
04
05
准备荧光物质和 蛋白质样品
测量荧光光谱
蛋白质与荧光物 质结合
测量结合后的荧 光光谱
计算分子量
选择适当的荧光物质，制 备已知浓度的蛋白质样品 。
在激发波长下照射荧光物 质，测量其发射波长下的 荧光光谱。
将蛋白质样品与荧光物质 混合，静置一段时间，使 两者充分结合。
再次测量荧光光谱，观察 荧光光谱的变化。
01

SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质量pptPowe

SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质量pptPowe
SDS-PAGE测定蛋白质 的相对分子质量ppt-
Powe
2020/11/6
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
实验目的
n 了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原 理及操作技术。
n 学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对 分子量的技术。
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
n 2．配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜 的分离胶浓度。本实验采用SDS-PAGE不连续系统， 按下表的配制分离胶和浓缩胶。
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
试剂名称
分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis) 分离胶缓冲液 （pH8.9Tris-HCl） 浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis） 浓缩胶缓冲液 （pH6.7 Tris-HCl） 10% SDS
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
仪器、原料和试剂
n 仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量 注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常 头滴管等。
n 原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1 样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配 成混合蛋白质标准液。
SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质 量pptPowe
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/11/6
SDSPAGE测定蛋白质的10.20
8.54
2.00
2.00
5.20
4.60
混匀后，置真空干燥器中，抽气10min
0.10 0.10

第六章蛋白质的测定ppt课件

第六章蛋白质的测定ppt课件

计算
从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（μg）， 再计算样品中蛋白质的百分含量。
蛋白质含量（％）=[X（μg）×稀释倍数]÷(样品重 ×106)
试验注意事项
（1）Folin乙试剂仅在酸性pH条件下稳定，但此实验 的反应只是在pH10的情况下发生，所以当加试剂乙 时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破 坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
消化装置
原理
（2）蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。 (NH4)2SO4+NaOH→NH3↑+Na2SO4+H2O
原理
（3）吸收与滴定 用2%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定.
2NH3 + 4H3BO3→ (NH4)2B4O7 + 5H2O
(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4H3BO4
（2） Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨 酸引起，不同蛋白质含量不同而使显色强度稍有不 同。本法也可用于游离酪氨酸和色氨酸含量测定。
3）酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖 类、甘油 、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇） EDTA和脲素均会干扰反应。但质量分数或体积分 数在5％时，尿素、硫酸钠、硝酸钠、三氯乙酸、乙
<2> 加硫酸铜 作为催化剂，还可以做蒸馏时碱性指 示剂。
受热
CuSO4 → Cu2SO4+SO2↑+O2↑ C+ CuSO4 →Cu2SO4+SO2↑+CO2↑ H2SO4 + Cu2SO4 →CuSO4+SO2↑+2H2O↑
<3>氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化 钛。

蛋白质分子量测定方法研究进展【共21张PPT】

蛋白质分子量测定方法研究进展【共21张PPT】
优点：操作简单，容易掌握，成本低，分辨率高，重复效果好。
将它与经典的脉冲化工作方式的飞行时间质谱仪（TOF）直接联用，即我们常听到的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。
上样：防止样品溢出、正负极、电压
SDS-PAGE凝胶电泳
当蛋白质分子量在10-200kDa时，样品的迁移 率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方 程式： lgMW = -b﹒Rf + K
的曲线方程和样品流出体积计算样品的分子量。
凝胶渗透层析法
• 优点：操作简单，设备简单，样品用量少，周期简单，条件温和 ，一般不引起生物活性的改变。
• 缺点：应用具有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关 系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。 糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与
，改变凝胶浓度，下图分别对应于凝胶浓度为5%，10%，15%。
SDS-PAGE凝胶电泳
• 优点：操作简单，容易掌握，成本低，分辨率高，重复效果好 。
• 缺点：对于电荷异常或者构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白及一些 结构蛋白测定的分子质量不太可靠，而且电泳结束后还需要染色，染色 ，脱色比较耗时。
凝胶渗透层析法
原理：基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）是将待测物悬浮或溶解在一个基体中，基体与待测物形成混晶，当基体吸收激光的能量后， 均匀传递给待测物，使待测物瞬间气化并离子化。 （3）有利于对复杂混合物的分析，且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分，降低了对样品预处理的要求； 近年来，生物质谱技术取得了突飞猛进的发展，其中以分别由 科学家和 科学家田中耕一发明的电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）及基质辅助激光 解吸电离质谱技术（MALDI-MS）的贡献最为突出。 电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS） 在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。

蛋白质分子量的测定共72页

蛋白质分子量的测定共72页

蛋白质分子量的测定
•
26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
•
27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
•
28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
•
29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
•
30、风俗可以造就法律，也已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特

凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量.完美版PPT

凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量.完美版PPT

【应用】
生物大分子的纯化 分子量测定 脱盐及去除小分子杂质 去热源物质 溶液的浓缩
【操作方法】
一、凝胶的选择和处理
量取110mL Sephadex G-75于250 mL烧杯中， 加入洗脱液100mL，在沸水浴中煮沸1h，冷却至室温 后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。
二、装柱
1）取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
即 Ve＝Vo＋Vi
推出 Vi＝ Ve －Vo
柱床体积（Vt）：
1)可用下式计算： Vt＝π×（D/2）2×h
2）根据 Vt＝Vo＋Vi 可以得到
3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的 体积。
分配系数 表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度
分配关系。
Kav
＝
Ve －
VVot －Vo
例如Sephadex G-75 吸水率 7. 3）分别收集各标准蛋白质的洗脱峰（灵敏度0.
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 外水体积（Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积内水体积（Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。
五、未知样品蛋白质分子量的测定 由于Ve 和Kav也成线性关系所以同样有：
的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时
所流出的体积。 Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。
对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其洗
脱体积
Ve ＝ Vo
对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，
故其洗脱体积 Ve ＝ Vt
分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之 间。
吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包 括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。 Sephadex G-25～200 数字是吸水率×10 例如Sephadex G-75 吸水率 7.5±ml/g 床体积指1g干的凝胶吸收水后的最终体积
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核糖核酸酶由124个氨基酸残基组成，有4对二硫键。用尿素和β-巯基乙 Байду номын сангаас处理该酶溶液，分别破坏次级键和二硫键，肽链完全伸展，变性的 酶失去催化活性；当用透析方法去除变性剂后，酶活性几乎完全恢复， 理化性质也与天然的酶一样。
概率计算表明，8个半胱氨酸残基结合成4对二硫键，可随机组合成105 种配对方式，而事实上只形成了天然酶的构象，这说明一级结构未破 坏，保持了氨基酸的排列顺序就可能回复到原来的三级结构，功能依 然存在。
17、一个人即使已登上顶峰，也仍要 自强不 息。上 午10时 2分29 秒上午 10时2 分10:0 2:292 0.9.22
谢谢大家
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◆ 血红蛋白含铁也是0.335%，最低分子量也为16700，但 用其他方法测分子量为68000，即每一个血红蛋白含有4 个铁原子，由此计算更为准确分子量为： 16700× 4=66800。
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2
◆ 2．凝胶过滤法
◆ 凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子 量的大小。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一 特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量 的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几 种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析， 以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数 作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样 的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积， 从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分 子量。
蛋白质分子量的测定方法
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◆ 1．根据化学组成测定最低相对分子质量
◆ 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假 设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出蛋白质 的最低分子量。肌红蛋白、血红蛋白均含铁0.335%，分 别求它们的最低分子量：
◆ 肌红蛋白为55.8（Fe原子量）÷ 0.335× 100=16700，与 其他方法测分子量相符。
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◆ （三）分子病
◆ 分子病是指机体DNA分子上基因缺陷引起mRNA 分子异常和蛋白质生物合成的异常，进而导致机 体某些功能和结构随之变异的遗传病。在1904年， 发现镰刀状红细胞贫血病。大约化费了40多年才 清楚患病原因，患者的血红蛋白（HbS）与正常 人的（HbA）相比，仅β-链的第6位上，Val取代 了正常的Glu。目前全世界已发现有异常血红蛋白 400种以上。
◆
12、人乱于心，不宽余请。10:02:29 10:02: 2910: 02Tuesday, September 22, 2020
◆
13、生气是拿别人做错的事来惩罚自 己。20 .9.222 0.9.22 10:02: 2910: 02:29 Septe mber 22, 2020
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14、抱最大的希望，作最大的努力。 2020 年9月2 2日星 期二上 午10时2 分29 秒10:02 :2920. 9.22
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15、一个人炫耀什么，说明他内心缺 少什么 。。20 20年9 月上午 10时2 分20.9 .2210: 02Sep temb er 22, 2020
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16、业余生活要有意义，不要越轨。 2020 年9月2 2日星 期二10 时2分2 9秒10: 02:29 22 September 2020
◆
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◆ （二）种属差异 ◆ 大量实验结果证明，一级结构相似的多肽或蛋白质，其
空间结构和功能也相似，不同种属的同源蛋白质有同源序 列，反映其共同进化起源，通过比较可以揭示进化关系。 ◆ 例如哺乳动物的胰岛素，其一级结构仅个别氨基酸差异 （A链5、6、10位，B链30位），它们对生物活性调节糖 代谢的生理功能不起决定作用。 ◆ 从各种生物的细胞色素C(cytochrome c ) 的一级结构分析， 可以了解物种进化间的关系。进化中越接近的生物，它们 的细胞色素c的一级结构越近似。
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◆ 3．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
◆ 蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质 分子的大小、分子形状和所带电荷的多少。SDS（十二烷 基磺酸钠）是一种去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。 当蛋白质样品中加入SDS后，SDS与蛋白质分子结合，使 蛋白质分子带上大量的强负电荷，并且使蛋白质分子的形 状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的带电 荷量和分子形状的差异。这样电泳的速度只取决于蛋白质 分子量的大小，蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子 质量的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数和 其相对迁移率作图，得到标准曲线，根据所测样品的相对 迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。
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．蛋白质空间结构与功能的关系
◆ 蛋白质的空间结构是其生物活性的基础， 空间结构变化，其功能也随之改变。肌红 蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是典型的 例子。
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◆ 肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）都能与氧进 行可逆的结合，氧结合在血红素辅基上。然而Hb 是四聚体分子，可以转运氧；Mb是单体，可以储 存氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散。它 们的氧合曲线不同，Mb为一条双曲线，Hb是一 条 S型曲线。在低p(O2)下，肌红蛋白比血红蛋白 对氧亲和性高很多，p(O2)为 2.8torr(1torr≈133.3Pa)时，肌红蛋白处于半饱和 状态。在高p(O2)下，如在肺部（大约100torr） 时，两者几乎都被饱和。其差异形成一个有效的 将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统。
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◆ Hb未与氧结合时，其亚基处于一种空间结 构紧密的构象（紧张态，T型），与氧的亲 和力小。只要有一个亚基与氧结合，就能 使4个亚基间的盐键断裂，变成松弛的构象 （松弛态，R型）。T型和R型的相互转换对 调节Hb运氧的功能有重要作用。一个亚基 与其配体结合后能促进另一亚基与配体的 结合是正协同效应，其理论解释是Hb是别 构蛋白，有别构效应。
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5
蛋白质结构和功能的关系
◆ 1蛋白质一级结构和功能的关系
◆ 2蛋白质空间结构和功能的关系
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蛋白质一级结构与功能的关系
◆ （一）一级结构是空间构象的基础
20世纪60年代初，美国科学家C.Anfinsen进行牛胰核糖核酸酶的变性和 复性实验，提出了蛋白质一级结构决定空间结构的命题。
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9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定 。20.9. 2220. 9.22Tuesday, September 22, 2020
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10、低头要有勇气，抬头要有低气。 10:02: 2910: 02:291 0:029/22/20 20 10:02:29 AM
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11、人总是珍惜为得到。20.9.2210: 02:29 10:02S ep-20 22-Se p-20
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◆ 4．沉降法（超速离心法） ◆ 沉降系数（S）是指单位离心场强度溶质的
沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分 子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时， 由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉 降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光 学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降 行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根据 沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式， 即可计算出蛋白质的分子质量。