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动物细胞工程设计方案一、项目名称：____________________二、项目背景：____________________三、项目目标：____________________四、实验材料：1. 动物细胞：____________________2. 试剂：____________________3. 仪器设备：____________________五、实验方法与步骤：1. 动物细胞的培养：（1）取动物组织，剪碎并加入胰蛋白酶分解成单个细胞。
（2）制备动物细胞培养液体培养基，将细胞接种至培养基，放入二氧化碳培养箱中进行初代培养。
（3）当细胞增殖达到一定程度，出现接触抑制现象时，用胰蛋白酶再次处理，并用细胞悬液吹打贴壁生长的细胞。
进行细胞计数。
（4）依照计数结果，分瓶培养，进行传代培养。
获得细胞系或细胞株。
2. 动物细胞融合：（1）选择适当的融合方法，如电融合、聚乙二醇诱导融合等。
（2）将目的细胞和辅助细胞进行融合实验。
（3）筛选融合细胞，并进行鉴定。
3. 动物细胞核移植：（1）取成熟雄性青蛙的体细胞，去除细胞核。
（2）将正常雄性青蛙的体细胞的细胞核移植到去核卵细胞中。
（3）将移植后的卵细胞培养至胚胎阶段。
（4）将胚胎移植到受体青蛙中，观察发育情况。
六、预期结果：1. 成功培养出所需的动物细胞株。
2. 实现动物细胞融合，获得具有特定性状的融合细胞。
3. 成功进行动物细胞核移植，获得具有全能性的核移植胚胎。
七、实验结果分析与讨论：1. 分析培养出的动物细胞株的特性，与预期目标进行对比。
2. 分析融合细胞的性状，探讨融合效率和稳定性。
3. 分析核移植胚胎的发育情况，探讨细胞核全能性的实现程度。
八、实验结论：1. 成功实现了动物细胞工程的实验目标。
2. 掌握了动物细胞培养、融合和核移植的基本技术。
3. 为后续相关研究提供了实验基础和参考。
九、实验注意事项：1. 严格遵守无菌操作原则，确保实验材料的纯净度。
《动物细胞工程》综合设计实验一、实验目的1 了解动物细胞培养基本设备、器材、实验室设计及实验规则。
2 掌握动物细胞培养常用液体配制方法。
3 掌握细胞传代技术。
4 学习动物细胞形态观察及活性测得方法。
二、实验内容（见下具体实验）三实验报告：1完成细胞培养常用培养液配制2 完成细胞传代操作，并写出细胞传代步骤和注意事项。
3用柱状图表示MTT法测定黄花蒿植物浸出液对细胞的IC50 。
4 计数活细胞百分率。
实验1 动物细胞培养液的配制（参考细胞工程试验教程P 100）需要配制的动物细胞培养液包括：一、无血清培养基的配制二、D-hanks细胞平衡液的配制三、细胞消化液的配制四、双抗溶液的配制无血清培养基的配制（各组配制100ml）无血清培养基(RPMI-1640): 是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。
大量组分：按照以上配方，称取所需量加入1000ml去离子水即可。
20种氨基酸混合溶液：已配备用，取量为1ml加入1000培养液即可。
维生素溶液：已配制成母液，各种微生物母液取量1ml加入1000培养液即可。
D-Hanks 细胞平衡液的配制（每组配制100ml）D-Hanks 溶液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液。
主要用于配制配制培养液，稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞，组织培养液。
NaCl 160gMgSO4·7H2O 2gKCl 8gMg Cl2·6H2O 2gCaCl22.8g溶于1000ml双蒸水细胞消化液的配制（各组配制10ml）0.25%胰蛋白酶细胞消化液：称量胰蛋白酶0.25g和EDTA-Na 0.02g 溶于100ml的D-Hanks 溶液，磁力搅拌溶解后，0.22um细菌过滤器过滤除菌。
-20℃保存备用。
双抗溶液配制（已配，备用）（1）氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
细胞工程第一讲一、 概述1、 细胞工程( cell engineering) 定义应用现代细胞生物学、 发育生物学、 遗传学和分子生物学的原理方法与技术, 按照人们的需要, 在细胞水平上进行遗传操作, 包括细胞融合、 核质移植等方法, 快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。
2、 细胞工程的研究内容( 1) 动植物细胞和组织培养植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备, 日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。
动物细胞培养用于制备单克隆抗体、 疫苗、 生长因子等。
( 2) 细胞融合改良性状, 培育新品种( 3) 染色体工程主要用于培育单倍体或多倍体新品种, 如四倍体小麦, 八倍体小黑麦( 4) 胚胎工程主要是获得人们需要的成体 细胞工程动植物细胞和组织培养细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程器官培养 组织培养 细胞培养( 快速繁育和产物大量制备) ( 改良性状, 培育新品种)( 培育新品种, 单倍体和多倍体) ( 获得人们需要的成体) ( 无性繁殖, 改变性状) 克隆 转基因技术如: 胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿( 5) 细胞遗传工程克隆: 无性繁殖, 动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。
转基因技术: 将外源基因整合到生物体内, 能够表示并稳定遗传给后代的实验技术。
3、细胞工程的优势( 1) 避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作, 只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。
( 2) 不但能够在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间, 甚至能够在三者之间形成前所未有的杂交物种。
4、细胞工程发展( 1) 萌芽阶段---理论渊源和早期的尝试( 20世纪初-30年代中期)德国植物生理学家Haberlandt在19 提出植物细胞的全能性。
认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。
美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人, 19 , 以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程, 首创了体外组织培养法。
( 2) 奠基阶段---离体培养技术的建立( 20世纪30年代中期-50年代中期) 1934年美国植物生理学家White经过培养番茄根, 建立活跃生长的无形繁殖系, 而且在28年间转接培养1600代仍能生长。
并正式提出植物细胞全能性学说。
1940年, Earle建立无限传代的小鼠结缔组织L细胞系;1954年, 美国微生物学家索尔克利用原代培养的猴肾细胞制备脊髓灰质炎疫苗并进入工业化生产。
( 3) 蓬勃发展阶段---各种新物种的出现( 20世纪50年代末-至今)1958年, 利用胡萝卜髓细胞形成了体细胞胚, 并发育成完整植株。
1960年, 植物原生质体和体细胞杂交成功。
在育种及次生代谢产物生产方面飞速发展,1958年, 冈田善雄灭活的仙台病毒诱导肿瘤细胞融合, 开创了细胞融合的崭新领域。
三色鼠:绵山羊:5、细胞工程的应用( 1) 粮食与蔬菜生产利用细胞工程技术进行作物育种, 是迄今人类受益最多的一个方面。
中国在这一领域已达到世界先进水平, 培育出的水稻品种或品系有近百个, 小麦有30个左右。
培育的新品种, 具有抗倒伏、抗锈病、抗白粉病等优良性状。
( 2) 园林花卉植物细胞工程技术使现代花卉生产发生了革命性的变化。
如: 世界兰花市场上有150多种产品, 其中大部分都是用快速繁殖技术得到的试管苗。
从此, 市场供应摆脱了气候、地理和自然灾害等因素的限制。
至今, 已报道的花卉试管苗有360余种。
已投入商业化生产的有几十种。
中国对康乃馨、月季、唐昌蒲、菊花、非洲紫罗兰等品种的研究较为成熟, 有的也已商品化, 并有大量产品销往港澳及东南亚地区。
( 3) 临床医学与药物单克隆抗体并已成功地应用于临床治疗, 主要是针对一些还没有特效药的病毒性疾病, 特别适用于抵抗力差的儿童。
人类体外受精技术的日趋成熟, 使人类对生育活动有了较大的选择余地, 促进优生优育, 提高人口素质, 也为不孕症患者或不宜生育的人带来福音。
生物药品主要有各种疫苗、菌苗、抗生素、生物活性物质, 抗体等, 是生物体内代谢的中间产物或分泌物。
过去制备疫苗是从动物组织中提取, 得到的产量低而且很费时。
现在, 经过培养、诱变等细胞工程或细胞融合途径, 不但大大提高了效率, 还能制备出多价菌苗, 能够同时抵御两种以上的病原菌的侵害。
( 4) 繁育优良品种当前, 人工受精、胚胎移植等技术已广泛应用于畜牧业生产, 使优良公畜、禽的交配数与交配范围大为扩展, 而且突破了动物交配的季节限制。
另外, 能够从优良母畜或公畜中分离出卵细胞与精子, 在体外受精, 然后再将人工控制的新型受精卵种植到种质较差的母畜子宫内, 繁殖优良新个体。
综合利用各项技术, 如胚胎分割技术、核移植细胞融合技术、显微操作技术等, 在细胞水平改造卵细胞, 有可能创造出高产奶牛、瘦肉型猪等新品种。
6、细胞工程产业化发展前景( 1) 新兴高技术产业( 2) 细胞工程产品的应用人生长激素、促红细胞生成素、溶血栓药物、 MAb( 3) 医学治疗基因治疗、人造器官、干细胞治疗、体细胞治疗、抗癌免疫细胞治疗二、体外培养细胞的分型1、悬浮型细胞( suspend cell)不需要贴附在支持物上, 而是呈悬浮状态生长。
细胞悬浮生长时胞体为圆形。
细胞悬浮培养的优点是细胞生存空间大,生长时间长,能繁殖出大量细胞。
观察细胞病变时不如贴壁细胞方便。
2、贴壁型细胞( anchorage-dependent cell)细胞必须贴附在某一固相支持物上才能生长。
贴壁型细胞又分为4种1) 上皮型细胞( epithelium) : 细胞呈扁平不规则多角形, 中间有细胞核, 彼此紧密连接。
2) 成纤维型细胞( fibroblast) : 细胞贴壁后呈梭形或不规则三角形。
3) 游走型细胞( wandering) : 细胞质常伸出伪足或突起, 呈活跃的游走或变形运动, 分散生长不连接成片。
4) 多形型细胞( polymorphic) : 呈多角形, 并伸出很长的神经纤维, 很难确定其形状。
三、动物细胞的特点1、动物细胞比微生物细胞大, 无细胞壁。
2、动物细胞倍增时间长, 生长缓慢, 易污染。
3、培养过程需氧少, 对机械搅拌或剪切力敏感。
4、动物细胞间主要以聚集体形式存在。
5、原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。
四、动物细胞培养的定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织, 模拟体内的生理环境, 在无菌、适温和丰富的营养条件下, 使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术, 是动物细胞工程的基础。
五、动物细胞培养的基本条件1、培养工具2、培养器皿细胞培养板、培养瓶3、培养条件( 1) 温度: 37℃偏离这一温度, 细胞的正常代谢就会受到影响, 甚至造成细胞的死亡。
总的来说, 细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强。
温度不超过39度是, 代谢强度与温度成正比; 39-40度历时1小时, 会受到损伤, 但仍可能恢复; 41-42度, 会受到严重损伤; 43度以上时, 细胞全部杀死。
( 2) pH: 7.2-7.4不同细胞对pH的要求不一样。
但总起来说, 原代细胞对pH的耐受差, 而传代细胞和肿瘤细胞对pH变动的耐受强。
低于6.8或高于7.6都会对细胞产生不利的影响, 严重时导致细胞蜕变或死亡。
( 3) 气体: 氧, 二氧化碳氧气参与三酸酸循环, 产生能量供给细胞生长、增殖、及合成所需的细胞成分。
可是不能过高或过低, 过低时影响生长代谢, 过高时产生细胞毒性。
二氧化碳对于调节培养液的pH至关重要。
碳酸氢钠调节pH, NaHCO3+H2O=Na+ HCO3-+H2O=Na+ + CO2+ H2O + OH-( 4) 渗透压4、细胞培养常见液体1) 水: 配制各种培养液必须用纯水或新蒸馏的三蒸水。
2) 平衡盐溶液( balanced salt solution, BSS) : 平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成, 它的作用是维持细胞渗透压平衡, 保持pH稳定及提供简单的营养。
3) 消化液: 胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常见的细胞消化液, 原代培养时用于处理组织块, 使细胞分离下来。
传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面, 并分散成单个细胞。
4) pH调整液: 常见的有HEPES液和NaHCO3溶液。
5) 常见的是青链霉素, 俗称”双抗溶液”。
青霉素主要是对革兰阳性菌有效, 链霉素主要对革兰阴性菌有效。
加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。
一般使用青霉素终浓度0.007-0.008g/100ml,链霉素终浓度0.01g/100ml。
一般配制成100倍浓缩液, 可用PBS或培养基配制。
5、天然培养基( natural medium)血清成分由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物, 血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等, 这些物质能促进细胞生长增殖。
血清种类胎牛血清( fetal calf serum) , 新生犊牛血清( newborn calf serum) , 小牛血清( calf serum) , 马血清( horse serum) ,兔血清( rabbit serum) ,羊血清( sheep serum) ,人血清( human serum)血清的灭活血清经56℃水浴30min, 以避免血清中的补体成分对细胞的毒性作用。
血清的主要作用1) 提供基本营养物质: 氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等, 是细胞生长必须的物质。
2) 提供激素和各种生长因子: 胰岛素、肾上腺皮质激素( 氢化可的松、地塞米松) 、类固醇激素( 雌二醇、睾酮、孕酮) 等。
生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。
3) 提供结合蛋白: 结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质, 如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等, 转铁蛋白携带铁。
结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。
4) 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
5) 对培养中的细胞起到某些保护作用: 有一些细胞, 如内皮细胞、骨髓样细胞能够释放蛋白酶, 血清中含有抗蛋白酶成分, 起到中和作用。
6、合成培养基组成1. 氨基酸组成蛋白质的基本单位。
不同种类的细胞对氨基酸的要求各异, 但有几种氨基酸细胞自身不能合成, 必须依靠培养液提供, 这几种氨基酸称为必须氨基酸。
其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必须的氨基酸, 在缺少谷氨酰胺时, 细胞生长不良而死亡。
2．维生素维持细胞生长的生物活性物质, 在细胞代谢中起调节及控制作用。
