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02-动物细胞工程制药(1)

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动物细胞工程制药

动物细胞工程制药
离心 离子交换层析 凝胶过滤 亲和层析 盐析和有机溶剂沉淀 透析 高效液相层析
有该细胞系的历史资料 有该细胞特性的资料，要求100代以上传代稳定 无细菌、真菌、支原体和各种病毒
动物细胞产品质量要求——工程细胞
3.5.4 动物细胞产品质量要求——纯化工艺
生产厂房条件必须符合国家GMP规定 细胞培养尽量少用或不用小牛血清，要使用无热原水和无离子超净水 操作环境、柱体、洗脱液等的温度尽可能保持4度左右 所有器材、载体都需经无菌、无热源处理 应记录产品纯度、提纯倍数和回收率
3.5 动物细胞产品的纯化方法和质量要求
3.5.1 动物细胞产品纯化
工程细胞表达的产品与其它复杂成分混在一起，分离纯化难度大； 由于产品要用于人，对产品纯度要求高； 产物产量低，生物活性不稳定，增加纯化工艺的难度和复杂性； 细胞产品多样性，必须根据每一产品特点，研发专用的分离纯化技术。
3.5.2 常用纯化方法
生产用细胞库（MWCB）或称工作细胞库（WCB）
3.2 动物细胞培养的基本方法
细胞分离：离心分离和消化分离 细胞计数：自动细胞计数器计数、血球计数版计数、结晶紫染色细胞核计数法、MTT染色计数法。 细胞传代：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代 细胞冻纯：采用液氮低温冻存法 细胞复苏：要求快融。
3.3 动物细胞大量培养的方法和操作方式
杂质检测：1）宿主细胞残余蛋白小于1/1000；2）残余DNA量小于100pg；3）血清残余小于100ppm；4）其他物质；5）细菌、病毒和支原体检测阴性；6）热源检测。 稳定性 临床前安全性和有效性评价 临床实验的安全性和有效性评价
3.6 动物细胞制药前景与展望
采用更强的启动子和增强子 更好的利用扩增系统或寻找高表达位点 采用或改造更好的宿主细胞

生物制药工艺技术基础(1)

生物制药工艺技术基础(1)

医学ppt
22
③ 能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团 的液体培养，称为“悬浮培养” ；
④ 离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器 官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果 实的培养，称为“器官培养” ；
⑤ 未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则为“胚胎 培养”。
2、悬浮培养
悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分 散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件 下组织水平较低。
二、动物细胞工程制药技术基础 （一）动物细胞的获得
供生产生物技术药物的动物细胞有3类； 1、原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织器官，经过分散、 消化制得的细胞悬液。 2、二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而由多种细 胞成分的组织中挑选强化具有一定特性的细胞株。
医学ppt
1
其特点是：
①染色体组织仍然是2n的模型；
目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅 拌罐式生物反应器和气升式生物反应器。
2、贴壁培养
贴壁培养是必须让细胞附在某种基质上生长繁殖 的培养方法：它适用于一切贴附依赖性细胞（贴壁细 胞），也适用于兼性贴壁细胞。
医学ppt
8
该方法优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使 用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌流培 养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻 烦。
1、植物组织细胞无菌培养技术类型
植物组织和细胞是指在无菌和人工控制的营养 （培养基）及环境条件（光照、温度等）下，研究植 物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。
植物无菌培养技术有以下几类：
① 幼苗及较大植株的培养，即为“植物培养” （plant culture）；
② 从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组 织的培养叫做“愈伤组织பைடு நூலகம்养” ；

动物细胞工程制药

动物细胞工程制药

动物细胞工程制药导语动物细胞工程制药是一种利用动物细胞进行生物制药的技术。

该技术已经取得了显著的进展，并在医药领域发挥着重要作用。

本文将介绍动物细胞工程制药的原理、应用和前景。

一、动物细胞工程制药的原理动物细胞工程制药是利用动物细胞系统表达和生产药物的一种技术。

其主要原理包括以下几个步骤：1.动物细胞培养：首先需要选择合适的动物细胞系，并进行培养。

常见的动物细胞系包括CHO细胞、HEK293细胞等。

细胞培养的条件包括培养基、培养温度、培养时间等。

2.基因克隆和转染：将药物的基因通过基因克隆技术导入到动物细胞中，使其具有产生目标药物的能力。

转染的方式包括质粒转染、病毒转染等。

3.细胞培养和增殖：转染后的细胞需要在培养条件下进行生长和增殖。

通常会添加适当的生长因子和培养基来促进细胞的生长。

4.产物分离和提纯：最后，通过适当的方法分离和提纯目标药物，可以使用离心、超滤、层析等技术进行分离纯化。

二、动物细胞工程制药的应用动物细胞工程制药已经广泛应用于医药领域，为药物的研发和生产提供了重要的技术支持。

其主要应用包括以下几个方面：1.蛋白质药物生产：利用动物细胞工程制药技术可以生产多种重要的蛋白质药物，如抗体、细胞因子等。

这些蛋白质药物在治疗癌症、免疫性疾病等方面具有重要作用。

2.疫苗生产：动物细胞工程制药技术也可以用于疫苗的生产。

通过导入相应的病原体基因到动物细胞中，使其产生病原体相关的抗原，从而制备疫苗。

3.基因治疗：动物细胞工程制药技术还可以用于基因治疗。

通过将目标基因导入到患者的细胞中，实现对基因相关疾病的治疗。

4.抗病毒药物：某些动物细胞工程技术还可以用于抗病毒药物的生产。

通过将抗病毒基因导入到动物细胞中，使其产生抗病毒蛋白，从而对抗病毒感染。

三、动物细胞工程制药的前景随着基因工程和生物技术的不断发展，动物细胞工程制药在未来的前景十分广阔。

以下是动物细胞工程制药的一些未来发展趋势：1.技术的进一步成熟：随着技术的不断发展，动物细胞工程制药技术将变得更加成熟，能够更准确、高效地生产药物。

第3章 动物细胞工程制药

第3章 动物细胞工程制药
➢ 又如，HIV蛋白微球（microbicides）在局部使用可以
防止HIV传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产 量不够 。
➢ 还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家
也难以使用，估计有80%的血友病患者无药可用，主要 是生产能力不足。
➢ 生产能力不足也导致其价格不菲。
6 我国动物细胞工程制药的目标
单克隆抗 体技术
诊断流感病毒类 型和狂犬病治疗
抗体与药物结合，能定位杀 灭肿瘤细胞，避免和减少对 正常细胞的伤害，大大减少 抗癌药物的不良反应。
生物导弹
通过大量的细胞培 养获得细胞产品
鹿茸细胞
动物细 胞培养
病毒抗原的制备和疫 苗的生产
带状疱疹 水痘 传染 性肝炎疫苗
➢ 目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程
依赖性、接触抑制性及功能全能性： ⑤ 培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵； ⑥ 大规模培养时，不可照用微生物反应的经验；
⑦ 原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。
动物细胞培养的应用
疫苗 人 动物
单克隆抗体 免疫调节剂 酶 激素
动物细胞培养的产物 小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫 苗、疱疹疫苗等
细胞 COS CHO BHK MDCK MRC-5 Namalwa Vero WI-38
来源 非洲绿猴肾细胞 中国仓鼠卵巢细胞 仓鼠肾细胞 狗肾细胞 人胚肺组织细胞 淋巴母细胞样细胞 猴肾脏成纤维细胞 胚肺组织细胞
用途 小规模量单抗 表达重组蛋白 生产畜用疫苗 生产畜用疫苗 产生人用疫苗 生产a-干扰素 生产人用制品 生产人用疫苗
2．纯化蛋白 利用单抗对抗原（目的蛋白）的特异性结合性质，制备蛋白纯化柱。
3．医学诊断 用于疾病的诊断，包括癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫 等数百种疾病的诊断；

人教版高中生物选修三教学课件 2.2 动物细胞工程(1)

人教版高中生物选修三教学课件 2.2 动物细胞工程(1)

无限传代
2.2.1 动物细胞培养和核移植技术
2.2.1.1 动物细胞培养
3. 过程:
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分
细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为 细胞株。
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只
有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无 限制传代，这种传代细胞为细胞系。
2.2.1 动物细胞培养和核移植技术
2.2.1.1 动物细胞培养
5、动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于（ A.培养基不同； B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行； C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能； D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。 ）
2.2.1 动物细胞培养和核移植技术
C．原代细胞
D．传代细胞
2.2.1 动物细胞培养和核移植技术
2.2.1.1 动物细胞培养
3、动物细胞工程技术的基础是（ A.动物细胞融合 C.胚胎移植 ） B.单克隆抗体 D.动物细胞培养
4、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼 龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 （ A.容易产生各种变异 C.取材十分方便 B．具有更强的全能性 D．分裂增殖的能力强 ）
2.2.1 动物细胞培养和核移植技术
2.2.1.1 动物细胞培养
1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经
培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓疤细胞融合的是（ A.经过免疫的B淋巴细胞 ）
B.没经过免疫的T淋巴细胞
C.经过免疫的T淋巴细胞 D.没经过免疫的Ｂ淋巴细胞 2、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是 （ A．细胞系 B．细胞株 ）

动物细胞工程制药的研究进展

动物细胞工程制药的研究进展

动物细胞工程制药的研究进展动物细胞工程制药的研究进展1161001413167 刘星星摘要：动物细胞工程制药是动物细胞技术在生物制药工业方面的应用。

本文介绍了动物细胞工程制药所涉及的主要技术及其进展，包括动物细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等，在此基础上探讨了动物细胞工程制药的发展趋势。

关键词：动物细胞工程；生物制药；细胞融合；转基因动物；细胞培养2.传代细胞系(continuous cell lines,CCL)原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株称为CCL。

许多CCL 建立于50年代，用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量，并且因为所用的细胞性质均一，通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题。

但 C C L 在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处, 有时是从肿瘤细胞衍生而来, 由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性, 因而数十年间未允许 C C L 用于生产。

7 0 年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性, WI-38 是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系。

二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养 5 0 代，且无致瘤性，现在C C L 已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞系。

表 1 列出了一些常用的生产用动物细胞系。

3.工程细胞系工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。

用于构建工程细胞的动物细胞有BHK-21、CHO-dhfr、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9 等细胞系[1-2]。

SP2/0 - A g 1 4 工程细胞系是通过融合的方法，从抗羊红细胞活性的 B A L B / c 的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系P 3 X 6 3 A g 8 融合杂交瘤SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得，可用于生产单克隆抗体[2]。

生物化学动物细胞工程制药(ppt)

生物化学动物细胞工程制药(ppt)
COS细胞（非洲绿猴肾细胞）： 1981年，Gluzman用复制起点缺失的SV40(猿猴空泡
病毒40)转化非洲绿猴肾细胞CV-1，获得3个细胞系： COS-1、 COS-3 、 COS-7。
❖ COS细胞组成性表达SV40大T抗原，带有SV40 ori复制子 的质粒以附加体的形式高拷贝扩增（105 拷贝）
形态常为球形，可悬浮培养。
3、兼性贴壁细胞
不严格的依赖支持物 某些情况下可在培养基中良好悬浮生长。
二、动物细胞的生理特征 动物细胞培养的一些基本概念： 动物细胞体外培养可分为原代培养和传代培养（继代 培养）。
原代培养是指从机体取出组织或细胞进行初次培养的 过程。传代培养是指从原代培养的细胞继续转接培养。
细胞自发融合的频率很低，需要采用人工的 方式进行细胞融合，方法有3种：生物方法（病 毒）、化学方法（PEG）、物理方法（电融合）
目前，常用的为PEG和电融合。
（1）病毒诱导融合 可促进细胞融合的病毒有：疱症病毒、天花
病毒、副流感病毒、副黏液病毒等。 仙台病毒为副黏液病毒的一种，对人危害小
而且有效，使用最广。 起融合作用的为病毒被膜上
一、动物细胞的形态
离体培养的动物细胞主要为哺乳动物细胞。 根据是否需要帖附于支持物上生长的性质，可将动物细 胞分为贴壁依赖型和悬浮型两类。
1、贴壁依赖型 绝大多数细胞在培养时必须贴附在某一固相表面才能生存
和生长。
按培养细胞的贴壁的形态主要分为4类。
（1）成纤维细胞型
❖ 大量扩增质粒及高表达mRNA、蛋白质，易回收和分析
❖ 易培养、易转染。
CHO-K1细胞：
1957年，Puck等从中国仓鼠卵巢分离，上皮样细胞。
CHO-dhfr- 为二氢叶酸还原酶突变型(培养时需加入次 黄嘌呤、胸苷)，用于工程细胞构建。

动物细胞工程制药-2

动物细胞工程制药-2

灌流式操作

定义：当细胞和培养基一起加入反应器后， 在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部 分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培 养基

灌流式操作是近代用动物细胞培养生产各种 药品最受推崇的方式

优点：①细胞可处在较稳定的良好环境中，营 养条件较好，有害代谢废物浓度较低。②可极 大地提高细胞密度，一般都可达107-108个/时， 从而极大地提高了产品产量。③产品在罐内停 留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利 于产品质量的提高。④培养基的比消耗率较低，
半连续式操作

定义：当细胞和培养基一起加人反应器后， 在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段 时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养 基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样 数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续 培养

半连续式操作在动物细胞培养和药品生产中 被广泛采用

优点：操作简便，生产效率高，可长时期进 行生产，重复收获产品，而且可使细胞密度 和产品产量一直保持在较高的水平
缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。④可采
用多种生物反应器进行大规模培养，如搅拌罐式生 物反应器，气升式反应器等

结团培养：1980年首创，该方法用细胞本身作 为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培
养

优点：操作简便，节省了用于微载体的成本
二、动物细胞培养的操作方式

分批式操作
补料-分批（或流加式）操作
冶金研究所等单位制备成功一批葡聚糖类（MC-1
型、CT-1型、CT-3型）、聚苯乙烯类（SH-2型、 PS-1型）和胶原类（GT-2型）等微载体

微载体培养的优点：既可创造相当大的贴附面 积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的

生化药物制备第三章、动物细胞工程制药

生化药物制备第三章、动物细胞工程制药
行分离纯化。
1
超滤系统
通过超滤膜过滤去除杂质， 浓缩目标产物。
离心机
进一步分离纯化细胞和细胞 器。
冻干机
用于制备干粉制剂，保护药 物活性成分。
制剂生产设备
01
灌装机
将药液灌装到安瓿、西林瓶等包装 容器中。
贴标机
在包装容器上贴上标签，标明药品 信息。
03
02
封口机
对灌装好的包装容器进行封口，保 证密封性。
针对所选细胞系，筛选和优化培养基 成分，以满足细胞生长和产物表达的 需求。
细胞培养条件控制
对细胞培养过程中的温度、pH值、 溶解氧等关键参数进行严格控制，确 保细胞正常生长和增殖。
细胞扩增技术
采用适当的细胞扩增技术，如微载体 培养、流加培养等，实现细胞的大规 模扩增。
中游工艺：目标产物分离纯化
收获与预处理
随着精准医疗的发展，动物细胞 工程制药将更加注重个性化治疗
药物的研发和生产。
03
监管政策日益严格
面对不断加强的药品监管政策， 企业需要加强质量管理体系建设
，确保产品质量和安全。
02
新技术不断涌现
基因编辑、细胞重编程等新技术 将为动物细胞工程制药带来更多
创新机遇。
04
国际合作与竞争并存
加强国际合作，学习借鉴国际先 进经验和技术，同时积极应对国
05 动物细胞工程制药设备与 设施
细胞培养设备
生物反应器
用于大规模培养动物细胞，提 供恒定的温度、pH值、溶解 氧等条件。
离心机
用于细胞分离、沉淀和洗 涤等操作。
培养箱
提供细胞生长所需的恒温、 恒湿、无菌环境。
显微镜
观察细胞生长状态和形态 变化。

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动物细胞工程制药
张忠山 生命科学学院
• 一、概述 • 二、动物细胞的形态和生理特点 • 三、生产用动物细胞的要求和获得 • 四、动物细胞的培养条件和培养基 • 五、动物细胞培养的方法和操作方式 • 六、动物细胞生物反应器及其检测控制系统 • 七、动物细胞制药的前景和展望
第一节 概述
• （1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英 国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切 成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。
• 3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
• 当细胞培养开始，称之为原代培养，经过传代后， 即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决 于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培 养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。但是若向培养 基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原 来的50代增加至150代。
• 6、动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不 同
• 场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体， 前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上 合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多 数为糖蛋白。
• 蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高 尔基体中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖， 在高尔基体内加接的是O-链寡糖。
• 当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞 系，或称连续细胞系。
动物细胞培养一代生长过程
4、动物细胞对周围环境比较敏感 无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易
产生影响。
5、动物细胞培养基的要求高 与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、
8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为 主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因 子，而且不同种类要求又有变化。
二、动物细胞的生理特点

生物技术制药_03-动物细胞工程制药-9.25

生物技术制药_03-动物细胞工程制药-9.25

动物细胞工程制药

动物细胞培养技术

动物细胞培养基和添加剂 —— 血清

血清的成分：没有完全明确

蛋白质：白蛋白、球蛋白、转运铁蛋白等
激素：主要是细胞因子类，如生长因子等
代谢物、营养物、无机盐 抑制物

血清营养丰富，极易染菌、染毒 血清批次之间性质有差别，质量不稳定 成本高昂，且对产物分离有一定影响
操作过程（贴壁细胞）： 1.弃使用过的细胞培养基
（二）细胞的传代(subculture)：从原培养容器中分离细胞
2.清洗：使用PBS平衡盐溶液清洗细胞。
3.消化：加入消化液(trypsin)到长着细胞的一面。 孵育 在5-15分钟，仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。
4.吹打：当细胞变圆、离开培养皿底部时， 加入培养基， 通过移液管在细胞表面反复吹打分散细胞。计数并再次 培养细胞。
保持一定的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密 度不再增加。 一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层 生长，细胞密度可大大增加。


动物细胞工程制药

接触抑制
动物细胞工程制药

动物细胞培养所需仪器设备

动物细胞培养器具
动物细胞工程制药

动物细胞培养所需仪器设备

实验室要求
（A）和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等， 入内换上。 （B）室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥。 （C）侧部可设传递窗，用于物品传递。 （D）有消毒用紫外线灯
动物细胞工程制药

细胞系的选择

几个概念

细胞系（cell line）

由原代培养经传代培养纯化，获得的能在体外生存的细胞群体

《第2章第2节 动物细胞工程—动物细胞培养》分层作业1

《第2章第2节 动物细胞工程—动物细胞培养》分层作业1

《第2章第2节动物细胞工程—动物细胞培养》分层作业1一、单选题1．如图是动物细胞培养过程中可能出现的接触抑制现象，对此下列有关叙述错误的是（）A．正常动物细胞培养过程中均会出现接触抑制现象B．癌细胞无接触抑制因而培养时可形成多层细胞C．出现接触抑制时细胞将停止分裂活动D．出现接触抑制后需利用胰蛋白酶消化后才可进行传代培养2．下列有关动物细胞培养及细胞工程的叙述，正确的是（）A．动物组织培养过程中不会出现细胞的分化B．动物成熟体细胞的细胞核仍然具有脱分化和使其后代细胞再分化实现全能性的能力C．培养骨髓瘤细胞时要定期使细胞从培养瓶壁上脱离，以解除接触抑制D．细胞传代培养过程中，一定要用到胰蛋白酶处理3．某研究小组为测定药物对体外培养细胞毒性的大小，准备对某种动物的肝肿瘤细胞（甲）和正常肝细胞（乙）进行动物细胞培养。

下列说法正确的是（）A．制备肝细胞悬液时，可用胃蛋白酶代替胰蛋白酶处理肝组织B．CO2培养箱中CO2浓度维持在5%左右，以促进细胞呼吸C．本实验应设置对照实验，以检测药物对甲、乙的毒性大小D．为防止细胞培养过程中细菌的污染，需适量添加干扰素4．下列关于动物细胞培养所需条件的叙述，错误的是（）A．无毒、无菌的环境B．温度与动物体温相近C．不需要O2，需要CO2调节培养液的pH D．合成培养基中通常需加入血清5．一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件（）①无毒的环境②无菌的环境③培养基需加动物血清④温度与体温相近⑤需要O2，不需要CO2⑥需要保持稳定的pHA．①②③④⑤⑥B．①②③④C．①③④⑤⑥D．①②③④⑥6．下列关于动物细胞培养的叙述，错误的是（）A．一般选取动物胚胎或幼龄组织细胞进行细胞培养B．为防止杂菌污染，可在培养基中添加一定量的抗生素C．培养动物细胞的培养基中无需添加血清、血浆，以免造成污染D．定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害7．下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。

细胞工程制药[优质内容]

细胞工程制药[优质内容]
二氧化碳的作用：细胞生长 需要、维持pH值。
精制课件
16
（4）倒置显微镜
精制课件
17
（5）纯化水装置
精制课件
18
动物细胞的培养基
动物细胞的培养基组成----氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类 物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素、缓冲系统。
1、培养细胞的生存环境和培养液要求 2、天然培养基 3、合成培养基 4、无血清培养基
合成培养基--是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成 的。如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
优点--标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。
缺点--缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。目前常用合成培养 基＋血清来培养细胞
合成培养基的类型： （A）Eagle培养基（内含13种氨基酸、9种维生素、多种无机盐） （B）Ham氏F10培养基（内含20种氨基酸、多种维生素、10种无机盐） （C）199培养基 （D）Waymouth氏MB752/1培养基 （E）NCTC109培养基
精制课件
2
微生物、动物、植物细胞培养特性
细胞种类
细胞大小（um）
微生物细胞
1~10
植物细胞
20~300
动物细胞
10~100
倍增时间（h）
0.3~5
大于12
大于15
营养要求
简单
复杂
复杂
对剪切力
不敏感
敏感
敏感
光照要求
不要求
要求
不要求
主要产物
氨基酸、抗生素、 色素、次生代 疫苗、抗体、多
核苷酸、有机酸 谢产物
精制课件
12
动物细胞培养所需 仪器设备

动物细胞工程制药

动物细胞工程制药
细胞的分化（或特化） 形态分化在离体培养同样也存在。 离体培养的细胞分为两类： 贴壁依赖型（anchorage-dependent）和 非贴壁依赖型（anchorage-independent），前
者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。
动物细胞 结构图
• 1、贴壁细胞
特点：支持物 长时呈放射状、 旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内 胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞 片。
（5）用光学显微镜可看到多角体，容易以此为 标记物来挑选阳性克隆。
（6）如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表 达外源基因。
• 另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体， 即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增。 构建此类载体一般含有如下基本成分： （1） 允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。多数含 有质粒pBR322或其衍生载体pAT153的序列， 包括能使质粒在细菌体内复制的起始位点和抗 生素标记基因。
• （2）MRC-5：特性和用途与WI-38相似， 1966年来源于14周正常男性，对多种人的病 毒敏感，用于疫苗的生产。
• （3）CHO-K1：1957年从中国地鼠卵巢中分 离的一株上皮样细胞。在培养时需加入脯氨 酸。核型为2n=20~22。目前广泛用于构建工 程细胞的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养 缺陷突变株CHO-dhfr-，它常用的培养基为 DMEM培养基，加0.1 mol/L次黄嘌呤和 0.01m mol/L胸苷，以及10%小牛血清。
动物细胞工程制药
• 一、概述 • 二、动物细胞的形态和生理特点 • 三、生产用动物细胞的要求和获得 • 四、动物细胞的培养条件和培养基 • 五、动物细胞培养的方法和操作方式 • 六、动物细胞生物反应器及其检测控制系统 • 七、动物细胞制药的前景和展望
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一、动物细胞的形态
• 贴壁细胞
这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞
依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面 上生长和繁殖。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形 态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。
• 悬浮细胞
这类细胞生长不依赖支持物表面，可在培养液中成悬 浮生长，通常呈圆形，如血液内的淋巴细胞。
a. 磷酸钙沉淀法：将溶解的 DNA 加在 Na2HPO4中， 逐渐加入CaCl2溶液，当 Na2HPO4和CaCl2形成沉 淀，DNA包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉淀 物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用
将DNA导入胞内。
优点：方法简单，可进行共转化
b. 电穿孔法：借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场，
⑤ 有良好的适于生存的外界环境
⑥ 及时分种，保持合适的细胞密度
一、动物细胞的培养条件
1. 器材的清洗和消毒
2. 水质
3. pH
4. 渗透压
5. 温度 6. 空气
1、器材的清洗和消毒
（1）器材的清洗： a. 浸泡（3%磷酸三钠） b. 刷洗 c. 泡酸（重铬酸钾、硫酸、水） d. 冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水） （2）器材的消毒灭菌：
2、二倍体细胞系
原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种
细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定 特征的细胞株 • 由于该类细胞寿命有限，一般从动物的胚胎组 织中获取。如WI-38、MRC-5、2BS等
3、转化细胞系 失去了正常细胞的特点，获得了无限增殖的 能力。 • 转化细胞系具有无限生命力，常常倍增时间较短，
显性作用基因，如neo基因 。
（4）有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法 融合法
细胞融合法
化学法
物理法
显微注射法 基因枪法
病毒法
重组逆转录病毒介导法
重组DNA病毒介导法 多瘤病毒样颗粒介导法
DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 原生质融合法 微细胞介导法 鬼影红细胞介导法 染色体介导法
对培养条件和生长因子等要求较低，更适于大规
模工业化生产。如Namalwa、 CHO、 BHK-21、
Vero细胞等。
4、融合细胞系
•
细胞融合：指两个或两个以上的细胞合并成一
个细胞的过程
•
目前常用的融合方法有：仙台病毒融合法、聚
乙二醇融合法、电融合法
（1）仙台病毒融合法（很少使用）
融合过程：
a. 病毒加入两种细胞（4℃），附膜，细胞凝聚
生产-干扰素。
五、细胞库的建立
用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：
1、 原始细胞库（master cell bank， MCB）
2、 生产用细胞库（manugacture’s working cell
bank，MWCB），或称工作细胞库（working
cell bank， WCB）。
原始细胞库是单一来源的均质的细胞，对于二倍体 细胞，应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。贮存 时须有该细胞的详细档案，包括： （1）该细胞系的历史：来源、年龄和性别、细胞分离
如HEPES、 Na2HPO4/ NaH2PO4缓冲系统、
NaHCO3/CO2缓冲系统等
4、渗透压
• 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透 压有一定耐受性。 • 最理想的渗透压为290~300mOsm/kg • 为调整培养液的渗透压，一般采用加减NaCl的方法：
1mg/ml NaCl---32mOsm/kg
b. 对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。
c. 利用扩增系统，不断增加其基因拷贝数，获得高
效表达而稳定的工程细胞株。
四、常用生产用细胞的特性
（1）WI-38 1961年，来源于女性高加索人正常胚肺组织的 二倍体细胞系。 该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME（Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制在7.2。细胞的倍增时间为24 h，有限寿命为50代， 上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。
• 兼性贴壁细胞
这类细胞并不严格地依赖支持物，如CHO细胞。
二、动物细胞的化学组成和代谢
• 动物细胞的化学组成 无机成分：水、无机盐 有机成分：蛋白质、糖类、脂类、核酸 • 动物细胞的代谢 糖、脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段 （1）大分子降解为小分子
（2）小分子代谢产生三个主要的中间产物
（3）中间产物进入三羧酸循环
• 细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞 生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精 心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变， 从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加
或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条
件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产 品。
第二节 动物细胞的形态和生理特性
第一节 概述
第二节 动物细胞的形态和生理特性
第三节 生产用动物细胞的要求和获得 第四节 动物细胞的培养条件和培养基 第五节 动物细胞培养的基本方法 第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式
第七节 动物细胞生物反应器
第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求
第九节 动物细胞制药的前景与展望
第一节 概 述
（3）Vero 1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。 是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高倍体率为
1.7%，可持续地进行培养。通常用的培养基为199培
养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的 增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于
人体。
（4）Namalwa 1972年来源于肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病人 体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞。 该细胞有2.8%的高倍体率，多数细胞有12~14条标 记染色体，单条X染色体，无Y染色体。通常用的培 养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于大规模
Robert Hooke 及其制作的显微镜
Leeuwenhoek首次观察到了活的细胞
• 德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann创 立了细胞学说。 • 1885年Roux用生理盐水成功培养鸡胚组织。 • 1907年Harrison成功培养了离体的蛙胚神经组织， 并观察到神经细胞突起的生长过程。开创现代 细胞培养的新纪元。
三、动物细胞的生理特点
1、细胞的分裂周期长：一般12~48 h 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 接触抑制现象：指细胞在生长过程中达到相互接触时停 止分裂的现象。
3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的：时间长短决定
于细胞来源的种族和年龄 原代培养 有限细胞系 无限细胞系（连续细胞系）
4、动物细胞对周围环境十分敏感 对理化因素敏感：如渗透压、pH、离子强度、剪切
一、生产用动物细胞的要求 二、生产用动物细胞的获得 三、基因工程细胞的构建和筛选 四、常用生产用动物细胞的特性
五、细胞库的建立
一、生产用动物细胞的要求
1、只有从正常组织中分离的原代细胞才能用来生产生 物制品，如鸡胚细胞、兔肾细胞等 2、二倍体细胞，即使经过多次传代也可用于生产，如 WI-38，2BS细胞等
使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源DNA沿小孔
进入细胞。 特点：转化效率较高，但进入的DNA拷贝数较低
如何筛选工程细胞？
a. 依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统： 如用HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶） 选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞；用G418 （Geneticin）选择系统，筛选neor的转化细胞。
力、微量元素等。
5、动物细胞对培养基的要求高 必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、 细胞生长因子、贴壁因子等。 6、动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同
• 动物细胞生产药物
缺点：培养条件高、成本贵、产量低
优点：分泌胞外、收集纯化方便，较完善的翻译后
修饰，与天然产品一致
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
动物细胞培养技术的发展
动物细胞培养
培养成功必备条件
① 所有与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持
绝对无菌，避免细胞外微生物的污染
② 必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质， 避免即使是极微量的有害离子的掺入 ③ 保证有适量的氧气供应 ④ 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物
1、真核细胞基因表达载体的构建
病毒载体：如牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒、
杆状病毒等
质粒载体：穿梭质粒载体
用杆状病毒做载体的优点
① 该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组； ② 插入7~8kb的DNA不影响正常病毒粒子的形成； ③ 多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源 基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒 子； ④ 多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占 全部蛋白质的20~30%；
的方法、所用的培养材料等；
（2）该细胞系的特性：形态、生长的特性、种源的特 性等； （3）对各种有害因子检查的结果。
• 生产用细胞库：从原始细胞库来，或从单一安瓿来， 或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培 养扩增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库。 • 生产用细胞库也必须建立档案，而且需要进行无菌 性和无细胞交叉污染的检查，生产时需确定其最高 使用的传代数。
⑤ 用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选 阳性克隆；
⑥ 如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。
构建质粒载体一般含有如下基本成分： （1）允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。
（2）含有能使基因转录表达的调控元件。