第三章动物细胞工程制药一､生产用动物细胞目前用于生物制药的动物细胞有4类,即原代细胞､二倍体细胞系,融合的或重组的工程细胞系和转化细胞系｡1原代细胞原代细胞是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液｡动物细胞生产生物药品的早期,一般用原代培养的细胞来生产疫苗,如鸡胚细胞､原代兔肾细胞､鼠肾细胞,淋巴细胞等,Ender最先用原代培养的猴肾组织细胞来生产脊髓灰质炎灭活疫苗｡原代细胞增殖能力有限,需要大量动物才能增加产量,费钱费力,限制了它的应用｡2传代细胞系原代细胞经过传代筛选克隆,从多种细胞成分中挑选并纯化出某种具有一定征的细胞株称为CCL｡许多CCL建立于50年代,用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量,并且因为所用的细胞性质均一,通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量,避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题｡但C CL在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处,有时是从肿瘤细胞衍生而来,由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性,因而数十年间未允许C CL用于生产｡7 O 年代以后,大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性,wI一38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系｡二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取,有明显的贴壁和接触抑制特性,有正常细胞的核型,一般可传代培养5 0代｡且无致瘤性,现在C C L已被广泛用于人用治疗性药物的生产,但仍不是理想的生产细胞系｡3工程细胞系工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组,获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系｡用于构建工程细胞的动物细胞有BHK一2l,CHO—dhfr､Namalwa､Vero､SP2/O,Sf一9等细胞系｡sP2/0一Ag l4工程细胞系是通过融合的方法,从抗羊红细胞活性的BALB/c的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞P3x63A98融合杂交瘤sP2/NL—Ag 亚克隆中分离获得,可用于生产单克隆抗体幢l｡目前用重组DNA技术改造的C H O细胞生产干扰素,白介素,E P O､单克隆抗体､诊断试剂以及其它各种蛋白质类药品已成为国际医药市场上的热销产品,但这些产品的生产规模普遍较小(大多为5~50升的小型培养罐)｡4转化细胞系通过某个转化过程形成的,常由于染色体断裂变成异倍体,失去正常细胞特点,而获得无限增殖能力｡转化细胞系具有长期培养,倍增时间短,对培养条件和生长因子等要求较低的特点,适于大规模工业化生产｡在生物制药中,可通过改造宿主细胞特性,如延长细胞周期.提高工程细胞原始表达水平等来提高药物的产量｡李红艳等研究空间环境对CH0(dhfr)细胞生长特性的影响,结果表明空间诱变致生长减慢的细胞株有利于提高目的蛋白的产量,为筛选优化的生物工程制药细胞提供可能｡目前cHo(dhfr)作为重要的基因表达受体细咆,已成功应用于表达促红细胞生成素(EPO)､重组乙型肝炎疫苗等生物制药领域｡二、动物细胞工程制药技术1细胞融合细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下,两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触,进而发融合并形成杂种细胞的现象｡细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,不仅在农业､工业的应用领域不断扩大,而且在医药领域也取得了开创性的研究成果,如单克隆抗体,疫苗等生物制品的生产｡在动物体细胞融合技术的基础上Kohler G和Milstein C将能产生特异性抗体的原代B淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合,创立了单克隆抗体制备的方法¨J｡国内外已培育出了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系,它们能分泌用于疾病诊断和治疗的单克隆抗体,如甲肝病毒､抗人IgM､抗人肝癌和肺癌,抗M—CSFR(Macrophage Stimat—ing Factor Receptor,巨噬细胞集落刺激因子受体)胞外区的单克隆抗体等”-9I｡目前单克隆抗体技术已趋成熟,许多产品已经进入产业化的生产阶段｡此外利用细胞融合技术可以生产各种免疫疫苗瘤细胞/树突状细胞融合疫苗是近年来国内外恶性肿瘤免疫治疗研究的热点,在各种动物模型及病人身上观察到肿瘤的消退｡Avigan等将乳腺癌或肾癌病人的自体癌细胞与树突状细胞在含有人粒一巨噬细胞集落刺激因子､白介素一4的自体血清中培养,加入聚乙二醇使两种细胞产生融合,融合细胞疫苗能使肿瘤消退11⋯,显示其在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景｡2转基因动物利用转基因动物乳腺反应器生产药或食品蛋白是生物制药领域近年来研究的热点之一｡因为乳腺是一个外分泌器官,乳汁不进入体内循环,不会影响到转基因动物本身的生理反应,从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物,不但产量高､易提纯,而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工,具有稳定的生物活性,因此又被称为动物乳腺生物反应器,所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊､牛等产量高的动物就相当于一座药物工厂｡20世纪80年代中期,英国科学家克拉克酋先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因,开创了研制动物乳房生物反应器的先河｡根据美国遗传学会预测,到2010年,所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达95%｡国外现已有数十家以动物乳腺反应器为心技术的公司,可生产a l一抗胰蛋白酶､人红细胞生成素,乳铁蛋白､人血清白蛋白､人血红蛋白及人凝血因子Ⅸ,Ⅷ和抗凝血酶Ⅲ､血纤维蛋白原､tP A 等十余种稀有药品,但只有为数极少的几种药用蛋白上市｡2006年6月,由美国Genzyme转基因公司研制成功的世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物嚷重组人抗凝血酶Ⅲ(商品名:ATryn)已经获准上市｡我国自l 998年在国家“863｡计划中将“转基因动物乳腺生物反应器”作为重大研究项目以来,也取得了一些较好的成绩｡l 996年研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子,EP0的转基因羊}l 998年曾溢滔等获得了能表达人血清白蛋白的转基因奶牛,2000年中国农业大学与北京兴绿原生物技术中心合作,成功获得了我国首例转有人al一抗胰蛋白酶基因的转基因羊_ 113l·2005年中国农业大学和北京济普霖生物技术有限公司联合研制的人乳铁蛋白和人乳清白蛋白转基因奶牛均获得高效表达,含量分别达到克/升和克/升｡标志了我国首次获得可商业化生产的动物乳腺生物反应器重组人类蛋白｡目前科学家们正在加紧开展重组蛋白纯化,临床前试验和临床试验等研究,力争早日实现我国动物乳腺生物反应器制药技术产业他｡3细胞核移植技术细胞核移植技术,是指将一个动物细胞的细胞核移植至去核的9日母细胞中,产生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物的技术｡科学家们已经先后在绵羊,小鼠､牛､猪､山羊等动物上获得胚胎细胞核移植后代,目前,体细胞克隆也在牛､山羊,小鼠等物种上均获得了成功｡若将转基因与细胞核移植技术获得的克隆动物工厂相结合,在生物制药方面具有巨大的潜在应用价值｡1998年,Rohl等只健康,同类的携带外源标记基因的转基因克隆｡Schnieke等118l用此法成功克隆出3只携带有人凝血因子I X基因转染绵羊早期胎儿成纤维细胞,以该细胞系为供体移植到去核卵母细胞中,经过电和化学刺激后,将卵母细胞植入假孕母绵羊体内发育,获得这3只绵羊,这3只绵羊能高水平地表达人凝血因子I X(125 Il g/m1)｡Cibelli等｡19恫样也获得3头转基因牛｡这些研究展示了转基因克隆动物技术的可能性,为细胞工程制药带来了光明前景｡4动物细胞大规模培养动物细胞的大规模高效培养技术是生物制药的关键技术｡通过动物细胞培养生产生物产品已成为全球生物工业的主要支柱｡目前动物细胞培养生产较多的生物制剂是蛋白和抗体,通常采用中国仓鼠的卵巢细胞,事先将能产生某种蛋白质药品的基因片段与仓鼠卵巢细胞的DNA融合.再在培养液中大量培养它们､最后得到所需药品｡与微生物发酵法比,虽然产量相对较低｡但设备费用节省得多,如属于小品种､小产品类生物工程产品｡可采用此法｡目前用于动物细胞体外培养的生物反应器有机械搅拌式､气升式,中空纤维式,回转生物反应器等｡国外占主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养,为提高细胞的产率,可采用流加或灌注培养及微载体培养等相关技术‘20-2“｡美国Genentech公司使用cHO细胞以12,000L搅拌式生物反应器培养槽生产t—PA重组蛋白以及治疗癌症的生物药物｡美国Gibco公司建立的流加悬浮培养rcHO表达r D Gal系统,采用化学修饰的无蛋白C HO细胞培养基并增加TCA循环,生物反应器中活细胞密度最高可达107cell/ml｡国内第四军医大学采用5L CelliGen反应器连续灌注培养杂交瘤细胞,培养第9天细胞密度达到8×106 cells/ml以上I 2”｡目前国内未见有万升级的生物反应器用于生产的报道,同时我国有关商品化大规模动物细胞反应器产品还处于空白,有待于迸一步改进现有生物反应器设计或设计新型的生物反应器｡三、发展前景根据我国动物细胞工程制药的现状,今后应该将重点放在以下方面:(1)建立动物细胞大规模培养的技术平台｡该技术是转基因工程药物､单克隆抗体及疫苗等产品的关键技术,主要由以下几个要素构成:1)高效的真核细胞表达系统｡中国仓鼠卵巢细胞(C H 0)作为宿主细胞表达的外源蛋白最接近其天然构象,是生物制药最为理想的表达系统,但也存在一些问题,如表达量低､大规模培养困难､生产成本高昂｡我们应从工程细胞本身着手,对细胞本身的生理特征进行改造,除了要求目的蛋白的表达置高外,必须适应无血清培养基培养,具有即抗细胞衰老凋亡能力,2)性能优越的､个性化的细胞培养基,包括低血清培养基.无血清培养基,3)先进的生物反应设备｡(2)减少污染风险,提高产品质量和安全性,(3)实行“动物药厂”计划,尽快实现转基因动物乳腺生物反应器的产业化,(4)发展下游工程,主要是转基因表达产物及产品的分离纯化,在提高产品的纯度和产量同时,降低成本｡总之,我国动物细胞工程制药目前仍处于起步阶段,与欧美国家相比还有很大差距,虽然目前可生产多种有重要价值的蛋白质生物制品,如病毒疫苗､干扰素､单克隆抗体等,但大部分还处于实验和临床阶段｡随着生命科学的发展和细胞工程技术研究的深入,将会有更多的细胞工程药物出现,具有广阔的应用前景｡。
