血清尿素的测定标准操作规程

血清尿素的测定标准操作规程【目的】学习血清尿素(Urea)测定方法，了解其意义。

【原理】血清尿素（Urea）是蛋白质的正常代谢产物。

它的测定是常用的衡量肾小球功能的指标之一。

肾性血清尿素含量增加，提示肾小球损伤。

是研究药物肾毒性的重要指标之一。

【器材】兔固定架、注射器、烧杯、可见分光光度计、试管、水浴【药品】0.5%氯化高汞溶液、生理盐水【动物】家兔2只【方法】取家兔2只，1只注射氯化高汞5ml/kg（0.5%氯化高汞溶液1.0ml/kg)，另1只注射等量的生理盐水。

48小时后，从家兔耳静脉取血1ml，制取血清，按血清尿素测定方法测定血清尿素含量。

【结果】记录2只家兔血清尿素含量，比较并分析其差别。

附血清尿素(Urea)测定方法【原理】尿素与二乙酰在酸性反应环境中加热，缩合生成色素原二嗪化合物。

因二乙酰不稳定，不宜直接加入，可由化学反应生成。

通常由反应系统中二乙酰一肟与强酸作用，产生乙二酰。

二乙酰和尿素反应，缩合生成红色的二嗪。

根据颜色深浅确定尿素含量的多少。

【试剂】(1)酸性试剂：在三角烧瓶中加蒸馏水约100ml，然后加入浓硫酸44ml及85%磷酸66ml。

冷至室温，加入硫氨脲50mg及硫酸镉(CdSO4·8H2O)2g。

溶解后用蒸馏水稀释至1L，置棕色瓶中冰箱保存，可稳定6个月。

(2)二乙酰-肟溶液：称取二乙酰-肟20g，加蒸馏水约900ml，溶解后，再用蒸馏水稀释至1L，置棕色瓶中，贮放冰箱内可保存半年。

(3)尿素标准贮存液（100mmol/L）:称取干燥纯尿素(MW=60.06)0.6g，溶解于蒸馏水中，并稀释至100ml，加0.1g叠氮钠防腐，置冰箱内可稳定半年。

(4)尿素标准液应用液(5mmol/L)：取5.0ml贮存液用无氨蒸馏水稀释至100ml.【操作】按表T4-1进行混匀后，置沸水中加热12分钟，置冷水中冷却5分钟后，用分光光度计在波长540nm，以空白管调至零点。

比色读取标准管及测定管的吸光度。

血清尿素氮的测定【目的要求】1.了解血清尿素氮测定的方法及临床意义。

2.复习尿素的生成机理及其意义。

【实验原理】血清（或血浆）中的尿素，在尿素氮试剂的酸性环境中与二乙酰-肟（DAM）共沸后，可缩合成一红色化合物，称为fearon反应。

其颜色的深浅与血清（或血浆）中尿素的含量成正比，与同样处理的尿素氮标准液比色，即可测算出血清（或血浆）中尿素氮的含量。

【实验材料】1.器材刻度吸管（0.1ml、2ml、10ml）恒温水浴箱分光光度计2.试剂（1）待测血浆（2）尿素氮试剂（3）二乙酰-肟试剂（4）尿素氮标准液【操作步骤】取试管三支按下表操作1：4稀释血清（或0.1血浆）尿素氮标准液0.1（0.02mg/ml）蒸馏水0.1二乙酰-肟0.5 0.5 0.5尿素氮试剂 5.0 5.0 5.0 混匀，置沸水浴中加热15min，立即用自来水冷却5分钟。

分光光度计选用540nm波长，以空白管调零点，读取各管吸光度。

计算及结果分析尿素（mg%）×尿素氮标准液浓度*5(mg/ml；mg/100ml)【注意事项】1. 此法灵敏度高，用量极微（一般只需0.02ml血清即可）。

本实验是先将血清用生理水以1：4加以稀释再取0.1ml，故最后计算时，应乘以稀释倍数“5”2. 试剂中加入硫胺脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象（小于5%/h）。

3. 此法操作简单，特异性强，不受其他非蛋白质含氮化合物如尿酸、肌酸等影响，但应控制好实验条件。

4. 吸管必须校正，使用时务必注意清洁干净，加量务必准确。

5.尿液中的尿素氮也可用此法进行测定。

由于尿液中尿素氮含量高，标本需用蒸馏水以1:50稀释。

如果呈色后吸光度仍超过本法的线性范围，还需将尿液再稀释，重新测定。

【思考题】。

一、实验目的1. 掌握血清尿素测定的原理和方法。

2. 熟悉二乙酰-肟法测定血清尿素氮的实验操作。

3. 了解实验中可能出现的误差及其处理方法。

二、实验原理血清尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）是血液中尿素氮的浓度，是反映肾功能的重要指标。

尿素氮是蛋白质代谢的终产物，主要由肝脏产生，通过肾脏排泄。

二乙酰-肟法是一种常用的测定血清尿素氮的方法，其原理如下：在酸性反应环境中加热，尿素与二乙酰缩合，生成色素原二嗪，称为Feorin反应。

因为二乙酰不稳定，所以通常由反应系统中二乙酰-肟与强酸作用，产生二乙酰，二乙酰与尿素反应，综合生成红色的二嗪。

其颜色的深浅与血清中尿素含量成正比。

三、实验材料1. 试剂：- 碱性试剂：在三角烧瓶中加蒸馏水约100ml，然后加入浓硫酸44ml及85%H3PO466ml冷至室温，加入硫氨脲50mg及硫酸镉2g溶解后加蒸馏水稀释至1升，置棕色瓶放冰箱保存，可稳定半年。

- 二乙酰-肟溶液：称取二乙酰-肟20g，加蒸馏水约900ml溶解后，再用蒸馏水稀释至1升置棕色瓶中，贮存放于冰箱内可保存半年不变。

- 尿素标准贮存液（100mmol/L）：称取干燥纯尿素（MW60.06）0.6g，溶解于水中并稀释至100毫升，加0.1g叠氮钠防腐，置冰箱内稳定六个月。

- 尿素标准应用液（5mmol/L）：取5.0ml贮存液用去氨蒸馏水稀释至100ml。

2. 仪器：- 分光光度计- 离心机- 实验室试管四、实验步骤1. 标准曲线的绘制：- 取5支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0ml尿素标准应用液，用去氨蒸馏水稀释至5.0ml。

- 向每支试管中加入2.0ml碱性试剂，混匀。

- 将试管置于沸水中加热5分钟，取出冷却至室温。

- 以540nm波长，1cm光程，测定各管吸光度。

- 以尿素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品测定：- 取2支试管，分别加入0.5ml血清和0.5ml尿素标准应用液，用去氨蒸馏水稀释至5.0ml。

血清尿素氮的测定一 .实验原理血清中尿素在氨基硫脲存在下，与二乙酰一肟在强酸溶液中共煮时，可生成双乙酰和尿素形成的红色复合物( 二嗪衍生物)，其颜色深浅与尿素含量成正比，与同样处理的尿素标准液比色。

即可求得血清中尿素的含量。

由于反应在强酸中进行，所产生的羟胺是干挠物质，所以必须用氧化剂将其氧化除去。

在呈色反应中产生的有色复合物对光不稳定．加入氨基硫脲可增加其稳定性，还可提高尿素与双乙酰反应的灵敏度。

二 .实验操作取试管 3支，注明空白管、标准管、测定管，按下表操作管试号测定管标准管空白管剂血清(ml) 0.02 ————尿素氮标准应用液 (ml) ——0.02 ——蒸馏水 (ml) ————0.02二乙酰一肟试剂 (ml) 0.5 0.5 0.5尿素氮试剂 (ml) 5.0 5.0 5.0混匀后置沸水浴中煮沸12分钟，取出在冷水中冷却5分钟，分光光度计波长540nm比色，以空白管调零，测定各管吸光度值。

三 .计算测定管吸光度血清尿素氮（mmol / L ） = ——————— X 17.85标准管吸光度正常值参考范围3． 57～ 14． 28mmol／ L四 .临床意义血液中非蛋白含氮化合物包括尿素、尿酸、肌酸、肌酐、胆红素及氨等。

其中尿素含量约占l ／ 3～ 1／ 2。

尿素是蛋白质代谢的产物．通过肾脏排出，故测血清尿素氮可作为检测肾脏功能的试验，并且其增高程度与病变的严重程度呈平行关系。

五 .试剂1.尿素氮试剂：蒸馏水lOOml ，浓硫酸 44ml， 85％磷酸 66ml，冷却至室温后，加氨基硫脲50mg，硫酸镉 (3CdSO４· 8H 2O)2g ，溶解后稀释至1000ml。

2.20g／ L 二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟20g，加入蒸馏水约900ml，溶解后稀释至 1000ml.３.尿素氮标准贮存液 (357mmol／L)：称取尿素 1.072g溶解于蒸馏水中定容至 1000ml。

尿素测定标准操作规程1.检验原理：（酶偶联检测法）尿素经脲酶催化水解生成氨与二氧化碳，在谷氨酸脱氢酶催化下，氨与α-酮戊二酸、还原型辅酶Ⅰ（NADH ）作用生成谷氨酸与氧化型辅酶Ⅰ（+NAD ），还原型辅酶Ⅰ在340nm 波长处有吸收峰，而氧化型辅酶Ⅰ几乎无吸收峰，还原型辅酶Ⅰ在340nm 吸光度的下降速率与样品中尿素含量成正比。

尿素+2O H 2−−→−脲酶2+4NH +-23CO Α-酮戊二酸++4NH +NADH++H −−−−→−谷氨酸脱氢酶L-谷氨酸++NAD +O H 2 2.试剂主要组成成分3.样本要求：新鲜无溶血血清。

在22～25℃保存8小时，2～8℃保48小时，-20℃保存7天，样本不可反复冻融！样本中抗坏血酸含量≤0.3g/L 、胆红素含量≤0.4g/L 、血红蛋白含量≤5.0g/L 、脂血含量≤5.0g/L 对检测结果基本无影响。

4.检验方法；仪器法（详见DF-603/DI-600标准操作规程）5.参考范围：6.检验结果的解释：6.1样本含量超出线性范围时，建议用0.9%（W/V ）的氯化钠溶液稀释样本，最大稀释不超过10倍。

6.2.单位换算：mg/dl=mmol/L×6.027.检验方法的局限性7.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。

7.2若试剂浑浊，或以水空白在340nm处吸光度小于1.000时不能使用。

7.3检验结果仅供参考，不作为临床诊断的唯一依据。

8.试剂性能指标8.1试剂外观：无色透明液体，无悬浮物及沉淀。

8.2装量：不低于标识值。

8.3试剂空白8.3.1试剂空白吸光度：在340nm处，光径1cm时，空白吸光度A≥1.0008.3.2试剂空白吸光度变化率：在340nm处，光径1cm时，△A/min≤0.004.8.4线性区间：试剂的线性区间为[0.9-35.7]mmol/L，在此线性区间内：a）线性相关系数r应不小于0.9900；b)[0.9-4.0]mmol/L区间内，线性绝对偏差不超过±0.4mmol/L；[4.0-35.7]umol/L区间内，线性相对偏差不超过±10%。

尿素氮测定（速率法）1：概述尿素是人体内蛋白氮代谢的终产物，它构成了血液中绝大部分的非蛋白氮.尿素产生于肝脏，经过肾脏排泄至尿中，因此尿素的含量取决于蛋白质的摄入量，蛋白质分解代谢和肾功能。

2：标本的手收集新鲜无溶血标本，血清或血浆样本均不溶血.血浆样本只能采用肝素或EDTA抗凝。

样本在4摄氏度可稳定7天.采血前病人应禁食12小时,采集静脉3ml,待凝固后(最好放在37摄氏度水浴箱内45分钟）通常为加抗凝剂的血液在30—60分钟凝血析出血清.3000r/min离心5-10分钟,分离出血清备用.不建议采用血浆标本。

3方法原理样品中的尿素在试剂中脲酶的催化下与水反应生成氨和二氧化碳，生成的氨与试剂中的酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下产生谷氨酸，同时NADH被氧化为NAD+，从而使340nm处的光吸收值下降.通过监测340nm处光吸收值下降的速率，可计算出样品中尿素的浓度。

4剂来源，配置及储存试剂来源：试剂配置：试剂一和试剂二均为液体试剂,可直接使用。

启用后在2—8度可稳定30天.若试剂混浊,或以蒸馏水为空白在340nm处的光吸收值低于1.0A,应予丢弃。

试剂储存：试剂避光储存2-8摄氏度可稳定至标签所示失效期。

5分析仪器CS—600B全自动生化分析仪6计算方法ALT（U/L)=（A/min*Tv*1000）(6.3*Sv＊P）式中Tv=总反应体积Sv=样本体积6.3=NADH在340nm处的毫摩尔消光系数P=比色杯光径(cm）7 线性范围：本实验的线性范围：0—---35mmol/L8 参考范围:2。

82—-—8。

2 mmol/L9 失控控理1：立即重测同一质控品,如重测后结果仍不再允许范围,请进行下一步。

2：新开一瓶质控品，重测失控项目，如新开的质控血清结果正常,那么原来质控血清可能过期或在室温防止时间过长而变质，如结果仍不再允许范围，则进行下一步。

3：进行仪器维护，重测失控项目。

检查仪器状态,查明光源是否更换，比色杯是否需要清洗或更换？对仪器进行清洗等维护.另外还要检查试剂，此时可更换试剂已查明原因。