实验十七 血清尿素的测定(二乙酰一肟法)

一、实验目的1. 掌握血清尿素测定的原理和方法。

2. 熟悉二乙酰-肟法测定血清尿素氮的实验操作。

3. 了解实验中可能出现的误差及其处理方法。

二、实验原理血清尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）是血液中尿素氮的浓度，是反映肾功能的重要指标。

尿素氮是蛋白质代谢的终产物，主要由肝脏产生，通过肾脏排泄。

二乙酰-肟法是一种常用的测定血清尿素氮的方法，其原理如下：在酸性反应环境中加热，尿素与二乙酰缩合，生成色素原二嗪，称为Feorin反应。

因为二乙酰不稳定，所以通常由反应系统中二乙酰-肟与强酸作用，产生二乙酰，二乙酰与尿素反应，综合生成红色的二嗪。

其颜色的深浅与血清中尿素含量成正比。

三、实验材料1. 试剂：- 碱性试剂：在三角烧瓶中加蒸馏水约100ml，然后加入浓硫酸44ml及85%H3PO466ml冷至室温，加入硫氨脲50mg及硫酸镉2g溶解后加蒸馏水稀释至1升，置棕色瓶放冰箱保存，可稳定半年。

- 二乙酰-肟溶液：称取二乙酰-肟20g，加蒸馏水约900ml溶解后，再用蒸馏水稀释至1升置棕色瓶中，贮存放于冰箱内可保存半年不变。

- 尿素标准贮存液（100mmol/L）：称取干燥纯尿素（MW60.06）0.6g，溶解于水中并稀释至100毫升，加0.1g叠氮钠防腐，置冰箱内稳定六个月。

- 尿素标准应用液（5mmol/L）：取5.0ml贮存液用去氨蒸馏水稀释至100ml。

2. 仪器：- 分光光度计- 离心机- 实验室试管四、实验步骤1. 标准曲线的绘制：- 取5支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0ml尿素标准应用液，用去氨蒸馏水稀释至5.0ml。

- 向每支试管中加入2.0ml碱性试剂，混匀。

- 将试管置于沸水中加热5分钟，取出冷却至室温。

- 以540nm波长，1cm光程，测定各管吸光度。

- 以尿素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品测定：- 取2支试管，分别加入0.5ml血清和0.5ml尿素标准应用液，用去氨蒸馏水稀释至5.0ml。

二乙酰一肟法测尿素的原理二乙酰一肟法是一种常用于测定尿素含量的方法。

该方法基于尿素能与二乙酰一肟发生反应生成氨基脲的原理。

下面将详细介绍二乙酰一肟法测尿素的原理。

尿素是生物体代谢产物，也是一种重要的氮源。

测定尿素的含量对于了解生物体的氮代谢及肾功能等具有重要意义。

二乙酰一肟法是一种常用的尿素测定方法，其基本原理为将尿素与二乙酰一肟发生酰化反应，生成氨基脲。

具体的操作步骤如下：1. 取一定量的尿液样品，加入适量的三氯乙酸，使尿液中的尿素脱氢酶等酶失活。

2. 加入适量的二乙酰一肟试剂，与尿素发生反应生成氨基脲。

二乙酰一肟试剂的作用是使尿素与一肟酯发生酰化反应，生成稳定的酰尿素化合物。

3. 反应结束后，在碱性条件下，氨基脲水解，生成氨气。

可以利用此氨气的生成量来测定尿素的含量。

4. 使用比色法或者气相色谱法等进行测定，根据标准曲线计算出尿液中的尿素含量。

二乙酰一肟法测尿素的原理主要基于尿素与二乙酰一肟反应生成酰尿素的特性。

此反应是一个酯化反应，发生在酸性条件下。

二乙酰一肟试剂作为试剂，可反应生成具有稳定性和可检测性的酰尿素化合物。

此后，在碱性条件下，酰尿素水解生成氨气。

为了提高测定的准确性，二乙酰一肟法还可以结合其他方法进行测定。

例如，可以在水解反应结束后，用酚酞指示剂测定氨气生成量的酸度滴定法，或者使用离子选择电极进行电位测定。

这些方法可以更加准确地测定尿素的含量。

总结起来，二乙酰一肟法是通过尿素与二乙酰一肟试剂发生酰化反应生成氨基脲，再经过水解反应生成氨气来测定尿素含量的一种方法。

这种方法简单、灵敏且准确，因此被广泛应用于尿液中尿素含量的测定。

1. 熟悉血清尿素浓度测定的原理和方法。

2. 掌握生物化学实验的基本操作技能。

3. 了解血清尿素浓度与肾功能、蛋白质代谢的关系。

二、实验原理尿素是人体蛋白质代谢的终末产物，主要由肝脏合成，通过血液运输至肾脏排泄。

血清尿素浓度可以反映肾脏的滤过功能。

本实验采用二乙酰法测定血清尿素浓度，其原理是：在强酸条件下，二乙酰与尿素缩合成红色的二甲基氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。

三、实验材料1. 血清标本：收集患者空腹静脉血，分离血清。

2. 试剂：二乙酰试剂、硫酸、生理盐水、标准尿素溶液等。

3. 仪器：分光光度计、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 准备工作：将试剂、仪器等实验用品准备齐全，并校准分光光度计。

2. 标准曲线制作：取一系列标准尿素溶液，分别加入二乙酰试剂，室温反应一定时间后，用分光光度计测定吸光度。

以尿素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品测定：取血清标本，加入二乙酰试剂，室温反应一定时间后，用分光光度计测定吸光度。

4. 计算血清尿素浓度：根据标准曲线，查得样品的吸光度对应的尿素浓度，即为血清尿素浓度。

五、实验结果与分析1. 标准曲线：制作的标准曲线线性良好，相关系数R²大于0.99。

2. 样品测定：按照实验步骤对血清标本进行测定，得到吸光度值。

3. 血清尿素浓度计算：根据标准曲线，查得样品的吸光度对应的尿素浓度。

1. 实验过程中，要注意避免试剂污染，保证实验结果的准确性。

2. 标准曲线的制作要保证足够的浓度梯度，以便在测定过程中有足够的准确度。

3. 血清尿素浓度受多种因素影响，如肾功能、蛋白质摄入量、代谢分解情况等。

本实验测定的血清尿素浓度仅供参考，具体病情需结合临床综合判断。

七、实验结论通过本次实验，我们成功掌握了血清尿素浓度测定的原理和方法，了解了血清尿素浓度与肾功能、蛋白质代谢的关系。

在实验过程中，我们要严格遵守实验操作规程，确保实验结果的准确性。

八、实验建议1. 在实验过程中，加强实验室安全管理，防止意外事故发生。

一、实验目的1. 掌握血清尿素含量测定的原理和方法；2. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能；3. 了解血清尿素在临床医学中的意义。

二、实验原理血清尿素含量测定采用二乙酰-肟法，其原理如下：在强酸条件下，二乙酰与尿素发生缩合反应，生成红色的4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物。

该化合物的颜色深浅与尿素的含量成正比。

通过比色法，可以计算出血清中尿素的含量。

三、实验材料1. 试剂：二乙酰-肟试剂、血清、盐酸、氢氧化钠、蒸馏水等；2. 仪器：紫外可见分光光度计、移液器、试管、试管架等。

四、实验步骤1. 标准曲线绘制：（1）取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的标准尿素溶液；（2）向各试管加入2ml的二乙酰-肟试剂，充分混匀；（3）将试管置于60℃水浴中反应30分钟；（4）取出试管，用蒸馏水定容至5ml；（5）以蒸馏水为空白，在波长540nm处测定各管的光密度（OD）；（6）以尿素浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 血清尿素含量测定：（1）取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的血清样本；（2）按照标准曲线绘制步骤中的操作，进行反应和测定；（3）以蒸馏水为空白，在波长540nm处测定各管的光密度（OD）；（4）根据标准曲线，计算血清中尿素的含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：绘制标准曲线，结果显示尿素浓度与光密度呈线性关系，相关系数R²=0.998。

2. 血清尿素含量测定：根据标准曲线，计算各血清样本中尿素的含量，结果如下：样本1：尿素含量为5.2mmol/L；样本2：尿素含量为6.8mmol/L；样本3：尿素含量为7.4mmol/L；样本4：尿素含量为8.2mmol/L；样本5：尿素含量为9.0mmol/L；样本6：尿素含量为10.0mmol/L。

六、实验讨论1. 实验过程中，二乙酰-肟试剂的浓度、反应时间、温度等因素对实验结果有较大影响，应严格控制实验条件，以保证结果的准确性。

实验十七 血清尿素的测定（二乙酰一肟法）【目的】1. 掌握血清尿素的测定原理和方法。

2. 了解尿素测定的参考范围及临床意义。

【原理】尿素（urea ）在强酸、加热的条件下，与二乙酰缩合生成红色的二嗪化合物（Fearon 反应），其颜色深浅与尿素含量成正比。

与同样处理的标准液在540nm 处比色，求得尿素含量。

由于二乙酰不稳定，一般由二乙酰一肟与强酸作用产生。

其反应式如下：CH 3CH 3O O +H 2OH +CH 3CH 3O N OH +NH 2OH二乙酰一肟二乙酰羟胺CH 3CH 3O O 二乙酰+C ON H 2NH 2尿素H +CH 3C C 3N N C O+H 2O2二嗪衍生物【器材】试管、试管架、微量加样器及吸量管、沸水浴、分光光度计。

【试剂】 1．酸性试剂在三角烧瓶中加去离子水约100ml ，然后缓慢加入浓硫酸44ml 、85%磷酸66ml ，冷至室温，加入氨基硫脲50mg 及硫酸镉(CdSO4·8H 2O)2g ，溶解后移入1L 容量瓶中，加去离子水至1L 。

置棕色瓶中，4℃可保存半年。

2．二乙酰一肟溶液称二乙酰一肟20g 溶于去离子水中并定容至1L 。

置棕色瓶中，4℃可保存半年。

3．尿素标准贮存液(100mmol/L)精确称取于60～65℃干燥恒重的尿素(MW 为 60.06)0.6g ，溶解于无氨去离子水，并定容至100ml ，加0.1g 叠氮钠防腐，4℃可保存6个月。

4．尿素标准应用液(5mmol/L)取5ml上述贮存液用无氨去离子水稀释至100ml。

【操作】取试管3支，按下表操作：表3-19 血清尿素测定加入物 (ml) 空白管标准管测定管血清－－0.02尿素标准应用液－0.02 －去离子水0.02 －－二乙酰一肟溶液0.5 0.5 0.5酸性试剂 5.0 5.0 5.0混匀，置沸水浴加热 12分钟，取出置冷水中冷却 5分钟，以空白管调零，在 540nm 波长处读取各管吸光度。