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第七章重组体克隆的筛选讲义和鉴定

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重组克隆的筛选和鉴定

重组克隆的筛选和鉴定

1unit 0.5 umol/L
0.3 0.5 7.7
1.8 3 46.2
一、载体遗传标记法
——-半乳糖苷酶显色反应选择法
原理：



载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的 片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因 （ 片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能 的-半乳糖苷酶。
选择过程：
重组子因LacZ’基因的插入灭活而呈白色，非重组子则显蓝色
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
重组克隆筛选


凝胶电泳检测法质粒DNA的电泳 Nhomakorabea移率与其分子量大小成比例，带有 外源 DNA 插入序列重组体 DNA 比不具有外源 DNA 插入序
列的分子量较大，在凝胶中的迁移速度要缓慢些。
重组克隆的筛选和鉴定
原理

载体遗传标记法
1.抗药性筛选法 2.营养缺陷型筛选法 3. -半乳糖苷酶显色反应选 择法

其它方法
1.凝胶电泳检测法 2.PCR法
引言



转化子（接纳载体或重组分子的转化细胞）与 非转化子（接纳载体或重组分子的转化细胞）； 重组子（含有DNA重组分子的转化子）与非重 组子（仅含有空载载体分子的转化子）； 期望重组子（含有目的基因的重组子）与非期 望子（不含目的基因的重组子）


PCR法
利用合适的引物，以提取的质粒为模板进行PCR反应， 通过对PCR产物的电泳分析来确定目的基因是否重组入载 体中。
重组克隆筛选


PCR法的改进与优化
（1）以转化的单菌落为模板,通过PCR挑取 重组子克隆 ； （2）将待筛选的重组克隆重新进行液体培 养，而后进行PCR ；

基因克隆重组体构建、筛选与鉴定

基因克隆重组体构建、筛选与鉴定

基因克隆重组体构建、筛选与鉴定无论化学合成还是PCR扩增获得的目的基因要想导入宿主细胞克隆，进行后续功能的研究，必须与载体片段进行重组体构建。

目前，目的片段与载体连接主要有几个途径，一条途径是T 载体连接，另一条途径是酶切连接重组，还有一条途径是应用Gateway 技术进行重组。

利用Taq 聚合酶扩增目的基因往往会在每条链的3′端加上一个突出的碱基A，或者扩增后加上A 碱基。

T 载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3′端带有一个突出的T碱基，在连接酶的作用下，就可以通过AT 配对形成含有目的片段的克隆重组体。

构建到T 载体上的目的基因经鉴定后，为了后续功能研究，一般要通过酶切连接构建到表达载体上。

用于基因克隆的载体具有一段集中存在的单一限制性酶切位点，可以供目的基因插入使用。

而目的基因在获得的同时，一般人为地在基因序列两端也加入了相对应的酶切位点，利用相应的限制性内切酶，可以把环形质粒和目的基因切成带有相同黏性末端或平末端的DNA 片段。

酶切产物经纯化回收获得目的片段，在连接酶的作用下，对应的末端会通过碱基配对形成重组体。

酶切连接重组过程中，若载体和目的基因使用的是一种相同的限制性内切酶，就是一种单酶切的连接方式，在连接的重组体中，目的基因有正向连接和反向连接两种插入方式；如果载体和质粒都是采用两种相同的限制性内切酶切割（不全产生平末端），则目的基因酶切片段的两端就会分别与载体酶切末端互补连接，目的基因只能以一种特定的方向插入载体分子。

在酶切连接重组前，就要根据载体的多克隆位点序列设计目的基因序列两端的酶切位点，且一定要避免目的基因内部不能存在相同的酶切位点。

Gateway 重组技术是在离体条件下产生重组DNA 分子的新方法，其基础是在重组酶λ整合酶催化的位点特异性重组反应，该方法具有位点特异性特征。

在构建过程中，可以不依赖限制性内切酶，在重组酶的作用下可以高效、快速地将目的基因克隆到载体的特定重组位点。

重组体筛选和鉴定PPT课件

重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。

重组体克隆的筛选和鉴定

重组体克隆的筛选和鉴定

抗性筛选
通过载体上的抗性基因，如Amp抗性 基因，对重组体克隆进行筛选，重组 的克隆具有抗性。
筛选流程
转化
将目的基因和载体DNA共转化到大肠杆菌中 。
克隆筛选
根据筛选方法，从转化子中筛选出重组体克 隆。
培养和扩增
将筛选出的重组体克隆进行培养和扩增，以 备后续鉴定。
筛选中的注意事项
避免假阳性
在筛选过程中要严格控制条件，避免出现假阳 性结果。
生物化学鉴定法
通过检测表达产物的生化性质， 如酶活性等，判断目的基因是否 成功表达。
鉴定流程
构建重组体克隆
将目的基因与载体DNA连接， 形成重组体克隆。
转化受体细胞
将重组体克隆导入受体细胞中 ，使目的基因在受体细胞中表 达。
筛选阳性克隆
通过抗性筛选、PCR鉴定等方 法筛选出含有目的基因的阳性 克隆。
生物信息学技术
通过生物信息学技术，可以对重组体克隆进行全面的分析和鉴定，包 括基因组、转录组和蛋白质组等多个层面。
重组体克隆在其他领域的应用前景
生物制药
重组体克隆技术在生物制药领域具有广泛的应用前景，可用于生 产高纯度、高质量的药物。
生物能源
利用重组体克隆技术可以改良微生物，提高生物燃料的生产效率。
在生物制药领域的应用
药物靶点发现
01
通过筛选重组体克隆，可以发现新的药物靶点，为新药研发提
供基础。
药物作用机制研究
02
通过鉴定重组体克隆，可以深入了解药物的作用机制，为药物
优化提供依据。
药物筛选
03
利用重组体克隆进行高通量药物筛选，提高药物发现的效率。
在基因治疗领域的应用
基因功能研究

重组子筛选与鉴定

重组子筛选与鉴定

（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
④链霉素：Sm，Str，含Str抗性基因的菌体转译一种能修 饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体的结合，抗Sm菌落的终浓 度为25µg/ml，贮存液为20mg/ml水溶液。
⑤四环素：Tc，Tet，含Tc抗性基因的菌体转译能改变细 胞膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成， 抗Tc菌落的终浓度为12.5~15.0µg/ml，含Tc培养基中不可 加Mg盐，因Mg 盐拮抗Tc，贮存液为12.5mg/ml乙醇-水溶 液，含Tc溶液与培养液均应在暗处存放。
据转化的方法不同，转基因动物细胞的筛选方式 分为HAT选择法和共转化选择法两种。
① 胸腺激酶（TK）基因
HAT选择法的原理：
利用培养基中的叶酸类似物氨基喋呤（APT）阻 断细胞核苷酸的合成途径，启动以次黄嘌呤为底 物的补救合成途径。该途径不受APT的抑制，能 继续合成出所需核苷酸。
由于在HAT培养基中不加外源胸苷，通过TK酶 的作用，tk+细胞能以其为底物合成出TTP，故tk+ 细胞可以存活，而tk-细胞不能合成而死亡。
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
②氯霉素：Cm，Cmp，含Cat基因的菌体能转译 氯霉素乙酰转酰基酶，使Cm乙酰化而失效。抗 Cm菌落的终浓度为30µg/ml，贮存液为34mg/ml 乙醇溶液。
③卡那霉素：Km，kan，含kan抗性基因的菌体 转译能修饰km的酶，阻碍Km对核糖体的干扰， 抗Km菌落的终浓度为5µg/ml，贮存液为25mg/ml 水溶液。
2. 营养缺陷型检测法
根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛 选含目的基因的克隆子。
如果目的基因产物能够降解某些药物使菌株呈现 出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显 色反应，则可根据抗性或颜色变化直接筛选含目 的基因的克隆子。

基因工程重组体克隆的筛选和鉴定

基因工程重组体克隆的筛选和鉴定

基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。

重组子的筛选与鉴定

重组子的筛选与鉴定

1.2 -半乳糖苷酶显色反应选择法
1.2.1. 原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的 片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体 菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补 形成完整有功能的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶能把无 色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴 -4-氯靛蓝。
2.1 Southern blotting
Southern印迹杂交是由E Southern于1975年首先 建立并使用的，故名之。它是根据毛细管作用的 原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结 合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链 DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的 DNA片段。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛A 选A过程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
3、PCR扩增检测法
3.1 原理 PCR能在模（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
④漂洗去除游离的没有杂交上的探针分子，经放 射自显影后，便可鉴定出与探针的核昔酸序列同 源的待测DNA片段。据此可以将含有外源DNA片段 的重组子筛选出来。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选 结果
2.2菌落印迹原位杂交
是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上， 不必进行核酸分离纯化、内切酶酶解及电泳分离等操作， 而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位 结合，再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入 序列的菌落或噬菌斑。由于生长在培养基平极上的菌落 或噬菌斑，是按照其原来的位置不变地转移到滤膜上， 然后在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，所以菌落 杂交或噬菌斑杂交隶属原位杂交范畴。以菌落原位杂交 为例，操作步骤如下:

基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定

基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操 作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东 西。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。

第七章基因工程重组体克隆的筛选和鉴定

第七章基因工程重组体克隆的筛选和鉴定

Western装置
② Blotting 原理与ELISA相同。 PAGE胶 待测蛋白
硝酸纤 待测蛋白 一抗 二抗
维素膜
辣根过氧
化物酶
底物
产物， 并发出光
辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。
2）洗去未结合的一抗。 3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的
抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。 1. 原理
抗原—抗体 凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中，当插 入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围 时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。
1.原理：
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE）： ① SDS:
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis）

基因工程重组子选择筛选与分析精品PPT课件

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2．利用报告基因筛选植物转化细胞 在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因(reportor gene)，常用的报告基因有 抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等。
（1）利用抗生素报告基因筛选植物转化细胞 ① 新霉素磷酸转移酶（neomycinephosphotransferase-II, NPTII）基因 新霉素(neomycin)与卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素和 G418 等均属于氨基环醇类的抗生素，它们的结构相似，能抑制原核 细胞核糖体70S起始复合物的形成，从而阻碍了蛋白质的合成， 进一步抑制了细胞的生长。NptII基因催化ATP上- 磷酸基团转 移到上述抗生素分子的某些基团上，从而阻碍抗生素分子与靶 位点的结合，并使抗生素失活。因此，在含有上述抗生素的选 择培养基上培养植物转化材料仅有携带NptII基因的转化植物细 胞才能存活下来。
（3）利用抗除草剂基因筛选转基因植物细胞 Bar基因是1987年从水链霉菌中分离出来的，它编码的PPT- 乙酰 转移酶(PAT)能够解除非选择性除草剂的毒性。PPT是L-谷氨酸 的类似物，能强烈抑制谷氨酰胺合成酶(Gs)的活性，而谷氨酰胺 合成酶一旦受到抑制，将会导致植物体内氨的迅速积累，并使植 株死亡。 Bar基因的表达产物PAT通过对PPT的乙酰化从而解除 PPT的毒性，可以使转化植物细胞产生对除草剂的抗性。
② 氯霉素 (chloramphenicol, Cm 或 Cmp): 含 cat基因的菌体能转译氯 霉素乙酰转酰酶 (chloramphenicol acetyltransferase)，使Cm乙酰化 而失效。
③ 卡那霉素 (kanamycin, Kn或 Kan): 含Kan抗性基因菌体转译一种能 修饰Kn的酶，阻碍Kn对核糖体的干扰。 四环素(tetracymic, Tc或 Tet): 含Tc抗性基因的菌体转译一种能改变 细菌膜的蛋白，防止Tc 进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。 ⑥ 链霉素(strentomycin, Sm或 Str): 含Str 抗性基因的菌体转译一种能 修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。

重组克隆的筛选与鉴定精品文档

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②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。
④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培 养基上去找那些原始的克隆。
⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就 是含有重组pBR322质粒的重组子。
图 pBR322的结构图
在各自独立的情况下，pBS 和DH5α编 码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。 但在pBS 和DH5α融为一体时，可形成 具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。
4. α-互补现象
lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变 体与带有完整的近操纵基因区段的β-半 乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现 象。
1. 原理
在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如 BamH I位点，恰好在一个四环素抗性基因内。 如果有外源DNA插入BamH I位点，那么涉及 四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组 pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性， 但对四环素的抗性消失（敏感）。
2. 筛选的方法
①转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培 养基上，并培养至菌落出现。
pUC18/19的结构图
氨苄青霉素抗性基因 Lac Z基因：编码-半乳糖苷酶的部分
肽段。 Lac Z上有插入外源DNA的MCS位点。
4. 筛选的方法：蓝白斑法
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是 一种直接检测-半乳糖苷酶活性的方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培 养基，能合成-半乳糖苷酶。
2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一 定程度的互补顺序，即某种程度的同源 性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与DNA（Northern blot） 或RNA与RNA（In situ）的二条单链之 间进行。

重组体的筛选和鉴定

重组体的筛选和鉴定

1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。

转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理

具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18

19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
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三、酶联免疫吸附测定（ELISA） 四、免疫印迹（western blotting）法
四、免疫印迹（western blotting）法P109 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
1.原理：
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE）： ① SDS:
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。
2. 选择过程
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
精品
第七章重组体克隆的筛选 和鉴定
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定p205
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。
Tetr上有插入位点BamH I;
Ampr上有插入位点Pst I。
2. pBR322抗菌素标记选择
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。
主要检测插入片 断是否被转录。
从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
第五节 免疫化学检测法 P206
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法 二、免疫沉淀检测法
只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
Southern blot 筛选
结果
（1）原位杂交筛选P109
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程
用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复 性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNADNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环 形结构。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis）
在电场的作用下线性 蛋白质链在聚丙烯酰 胺凝胶介质中向正极 移动，移动的速率主 要取决于其分子量大 小（链的长短），从 而把不同分子量的肽 链分开。
电泳buffer
电泳buffer
点样
电泳方向
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
BamH I在Tc抗性基因上
转化处 理受体 菌
Amp
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨 嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
第四节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法P107
1. Southern blotting
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。
筛A 选A过程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
Amp
负选择
Tc
3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸培养液选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
2）转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
（2）Western blotting
① Western（转膜）
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法， 转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、 中性尼龙膜等）。
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重分子量组 克源自Marker 隆载体
二、酶切电泳筛选法
1. 原理：
根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
③蛋白质电泳的分子
Da
量标准
已知分子量的蛋白质 混合液，与待测样品 一起电泳，为样品蛋 白质提供分子量估计。
商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为6×1023道尔顿
Dalton SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色： 1）直接染色 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可 褪色回收。
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片 段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的半乳糖苷酶。