第8章 重组子鉴定与筛选
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重组子的筛选和鉴定
重组子可通过酶切进行鉴定,也可以利用扩增引物通过PCR 进行鉴定,阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR 产物。
1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml 含适当抗生素的LB 培养基中,37℃摇床培养过夜。
2. 次日取菌液0.2-0.5ml,12,000rpm×3min 离心,弃上清,加入20μl ddH2O 和20μl 酚/ 氯仿,震荡混匀,12,000rpm×5min 离心。
3. 取上清进行琼脂糖电泳,加入载体质粒DNA 作为阴性对照,根据质粒大小初步筛选重组子,重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。
4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。
5. 选取适当的酶,对重组子进行酶切分析,酶切体积均为10μl 体系。
酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。
6. 酶切分析正确的重组子分成两份,一份进行测序反应,另外一份保种。
7. 若用PCR 法鉴定,则在第 2 步时每个样本取0.5-1.0μl 菌液为模板进行PCR 反应,每管反应体系最低可少至10μl ,PCR 产物电泳,能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中,并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子,一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者,在这些被转化的受体细胞中,除部分含有我们期待的DNA分子外,另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此,需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义:1、转化子:导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子:含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子(期望重组子):含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选(选择):经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后,获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤:1.获得目的基因和质粒载体;2.形成重组质粒;3.制备感受态细胞,用重组质粒转化大肠杆菌细胞;4.培养大肠杆菌,让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝;5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
(1)方法:将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上,在最适生长温度条件下培养一段时间,根据菌落生长情况挑选出转化子。
(2)举例:抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
(1)报告基因的定义:一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因,即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达,出现新的遗传性状,以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
(2)成为报告基因的条件:报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如:gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。