第六章重组体的筛选与鉴定2008-1

A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选过程
A
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
三、PCR扩增检测法 1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程 （1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。
（2）氨苄青霉素抗性基因：
含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青 霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸：
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖
-半乳糖苷酶
半乳糖
Xgal
半乳糖
+ +
葡萄糖
5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
1. 原理：
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例：
降解
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。
DHFR 转化受 体菌
连接
载体
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。 一、直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆 中分离质粒，电泳、 比较其分子量。
（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
第四节 核酸杂交检测法
一、原理： 1. 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。 3. 识别标记 （1）放射性同位素 （2）非放射性标记
32P
或 125I 。
荧光素
二、核酸杂交检测方法 1. Southern blotting
转化率的影像因素
1. 载体DNA及DNA重组方面 载体自身性质，不同载体的转化效率不同 载体分子的空间构象（超螺旋与线性） 2. 受体细胞 受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配 3. 转化操作方面 受体细胞的预处理 感受态细胞的制备 4. 转化后重组子的整合与表达 如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
PCR方法建立以后，很快应用于基因靶位操作中转化 子的筛选。通过在目的突变基因中引人特定的PCR引 物顺序，利用PCR方法直接检测转化细胞组份或细胞 克隆的DNA结构，以特定扩增DNA片段的有无，鉴别 同源重组细胞克隆。Kim和Smithes首先应用PCR方法 成功筛选出ES细胞Hprt基因的定点突变克隆〔‘〕。随 后，Joyner等应用同样的方法，对小鼠ES细胞的en-2 基因进行了定点突变〔’〕；Zimmer等用PCR方法筛选 出同源异型盒基因hoxl.l定 点突变的ES细胞克隆，并得 到含该突变的嵌合体小鼠
有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）
临床检验常用的单抗
四、免疫印迹（western blotting）法
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。 1.原理：
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
2. 优缺点
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进 行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状 态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－ 蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接 结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在 实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体， 所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具 有冒险性。
（3）二抗结合 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物 酶、脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催 化反应转变成有色物质（或发光）。
（5）比色 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打 印出结果。
3.ELISA的局限性
（SDS-PAGE）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择 （1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
灵敏度不高, 实用性差
三、酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无 色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
125I标记的
检测目的基因相对应的标记抗体。 1. 原理
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原 之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的 经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互 作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被 裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相 互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X， 那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法 常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
（2）R-环检测法 1）原理： DNA-RNA杂交。 2）选择过程 用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复 性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNADNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环 形结构。
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交定克隆过程 由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很 少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使 用高度敏感和高度特异的筛选方法。
根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法 也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛 选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体 时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备 明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进 行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提 取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以 准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源 片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。 有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道 重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文 库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这 时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。
125I
标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
3. Broome-Gilbert双位点检测法 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白
质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 持滤膜
固相支 抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体 持滤膜 发光，底片曝光
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。
从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选 结果
（1）原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
重 组 分子量 克 Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后