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![一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/f7ea2d2cb6360b4c2e3f5727a5e9856a56122602.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610073412.7(22)申请日 2016.02.03C12N 5/0775(2010.01)C12Q 1/02(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)G01N 15/14(2006.01)(71)申请人广西大学地址530004 广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学东路100号广西大学动物科学技术学院(72)发明人杨素芳 韩杰 李海洋 邓彦飞石德顺 朱鹏 杨海燕 韦精卫李湘萍 黄奔(54)发明名称一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法(57)摘要本发明公开了一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法，包括以下步骤，1)脂肪干细胞的分离培养和纯化；2)脂肪干细胞的传代培养；按照本发明方法所得到的脂肪干细胞遗传稳定性好，体外连续培养到15代仍然保持遗传稳定性；干性好，体外培养传代到第18代仍具有间充质干细胞表面抗原特性；多向分化性能好，具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的能力。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书12页 附图5页CN 105602896 A 2016.05.25C N 105602896A1.一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤，细胞筛过滤后进行梯度离心，所述的细胞筛过滤和梯度离心重复两次，然后进行细胞培养，所述消化采用Liberase TL进行，所述消化的温度为37℃，时间为1～3h；所述的Liberase TL的浓度为15～25μg/mL，Liberase TL与脂肪组织的体积比为0.5～1∶1；2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的脂肪组织消化前还包括以下步骤：采集猪脂肪组织；将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有0.45～0.5g/L 青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的PBS溶液。
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后A C Ss的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除AS Cs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DM EM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsi n,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（C D29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
一、实验背景随着生物科技的发展，干细胞研究已成为医学领域的前沿课题。
脂肪干细胞（Adipose-derived Stem Cells，ASCs）作为一种易于获取、增殖能力强、多能性的干细胞，在组织工程、再生医学等领域具有广阔的应用前景。
本研究旨在探讨脂肪干细胞的分离、培养、鉴定及其在组织工程中的应用。
二、实验目的1. 探讨脂肪干细胞的分离、培养及鉴定方法。
2. 研究脂肪干细胞在组织工程中的应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：脂肪组织、DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、青霉素、链霉素、抗生素、鼠抗人CD105抗体、鼠抗人CD34抗体、鼠抗人CD29抗体、鼠抗人CD44抗体、鼠抗人CD45抗体等。
2. 实验仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、酶标仪、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 脂肪干细胞的分离与培养（1）将脂肪组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，用DMEM/F12培养基清洗3次，去除多余脂肪。
（2）加入0.25%胰蛋白酶消化脂肪组织，37℃水浴消化30分钟，1000r/min离心5分钟，弃上清。
（3）加入DMEM/F12培养基重悬细胞，吹打均匀，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 脂肪干细胞的鉴定（1）采用免疫荧光染色法检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
（2）采用流式细胞术检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
3. 脂肪干细胞在组织工程中的应用（1）将脂肪干细胞接种于生物降解支架材料上，构建组织工程化脂肪组织。
（2）将组织工程化脂肪组织植入小鼠皮下，观察其成活情况。
五、实验结果1. 脂肪干细胞的分离与培养成功分离出脂肪干细胞，细胞呈梭形，生长旺盛。
2. 脂肪干细胞的鉴定免疫荧光染色和流式细胞术结果显示，脂肪干细胞表达CD105、CD34、CD29、CD44，不表达CD45。
人脂肪干细胞的分离、培养及鉴定李玉秋;张雷雷;黄飞【摘要】目的:探讨胶原酶消化法从人脂肪组织中提取脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的可行性.方法:采用胶原酶消化法将真空抽脂术抽取的新鲜脂肪组织进行消化分离,获取ADSCs并进行培养,用流式细胞术鉴定ADSCs的表面特异性标志物CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果:利用胶原酶消化法可成功提取ADSCs,其标志物CD44和CD105表达阳性,CD34为低表达,CD45表达为阴性.结论:通过胶原酶法可成功提取人ADSCs.【期刊名称】《沈阳医学院学报》【年(卷),期】2018(020)006【总页数】4页(P495-498)【关键词】人脂肪干细胞;细胞分离;细胞培养;细胞鉴定【作者】李玉秋;张雷雷;黄飞【作者单位】山东华思生物科技有限公司,山东烟台 264003;山东华思生物科技有限公司,山东烟台 264003;山东华思生物科技有限公司,山东烟台 264003【正文语种】中文【中图分类】R329.2脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是2001年Zuk等［1］从真空吸脂术抽出的脂肪中发现的一种间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），其含量约占脂肪组织的10%～20%［2］。
ADSCs同其他MSCs一样，具有自我更新和多向分化的潜能，是成体干细胞的一种，在疾病治疗领域有巨大的潜力。
但ADSCs较骨髓干细胞有更高的提取率，其提取率可高达1%～2%，是骨髓干细胞的1 000倍［3］。
ADSCs已成为研究者们青睐的种子细胞，本文就ADSCs的提取、培养和鉴定进行研究。
1 材料与方法1．1 材料1．1．1 脂肪组织选取滨州医学院附属医院产科剖宫产产妇皮下脂肪组织，产妇无其他基础疾病，未经过特殊药物治疗，取材前均获得医院伦理委员会批准和产妇知情同意。
脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
人脂肪干细胞及其外泌体的分离与鉴定李洪超;金银鹏;王皙;李莉;王晓今;周荣;陈成伟;傅青春;程明亮【摘要】背景:间充质干细胞如今在科研领域被广泛地研究和应用,许多研究认为其发挥作用的机制很大程度上依赖于其旁分泌的外泌体.目的:分离纯化人脂肪干细胞来源的外泌体,并鉴定其生物学特性.方法:采用胶原酶消化法获得人脂肪干细胞,进行细胞表面分子标志和成骨、成脂分化能力鉴定.运用超滤法从人脂肪干细胞条件培养基中提取外泌体,应用扫描电子显微镜、粒度仪观察所获外泌体的形态和大小,采用抗体芯片检测外泌体所含蛋白质表达.结果与结论:①人脂肪干细胞呈梭形、漩涡状生长,细胞表面表达CD73、CD44、CD90、CD105分子,具备成脂、成骨等多向分化潜能,可证实为人脂肪干细胞;②大多数外泌体直径均在30-150 nm范围内;扫描电镜显示外泌体呈均一大小的圆杯形态;③抗体芯片显示外泌体含 FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、ANXA5、TSG101等多种特殊蛋白;④以上结果表明实验成功分离得到人脂肪干细胞外泌体.%BACKGROUND: Currently, mesenchymal stem cells have been widely explored and applied in scientific research field, and many studies suggest that the underlying mechanism of mesenchymal stem cells mainly relies on its exosomes. OBJECTIVE: To isolate and identify human adipose-derived stem cells and its exosomes, and to identify their biological characteristics. METHODS: Human adipose tissue was digested with collagenase l, and adipose-derived stem cells were isolated and purified. Immunophenotype, osteogenic and adipogenic abilities of adipose-derived stem cells were identified. Exosomes were isolated by using ultrafiltration method. Morphology of exosomes was observed by Nanosight and electronmicroscope. Expression of proteins in exosomes was detected by antibody array method. RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells exhibited long spindle-like or fibroblast-like appearance, expressed CD73, CD44, CD90, CD105 and had the potential to differentiate into many tissues, including bone and adipose tissues. The exosomes had the similar size, with the diameter of 30-150 nm. They possessed many proteins including FLOT1, ICAM, ALIX, CD81, CD63, ANXA5, TSG101, and so on. Findings from the present study indicate the successful isolation of exosomes from human adipose-derived stem cells.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)013【总页数】6页(P2033-2038)【关键词】外泌体;干细胞;间充质干细胞;脂肪干细胞【作者】李洪超;金银鹏;王皙;李莉;王晓今;周荣;陈成伟;傅青春;程明亮【作者单位】贵州医科大学临床医学院,贵州省贵阳市 550004;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;贵州医科大学临床医学院,贵州省贵阳市550004;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;贵州医科大学附属医院感染科,贵州省贵阳市550004【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，不仅能够从骨髓、脐带、脂肪中分离，也可以从脾脏、肝脏、肾脏、肺、胰腺中得到，尽管其组织来源不同，但是都拥有相似的表型特征[1-4]。
人脂肪间充质干细胞质量检定标准文档下载说明Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document 人脂肪间充质干细胞质量检定标准can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!人脂肪间充质干细胞（ADSCs）作为一种重要的多功能细胞类型，在再生医学、组织工程和干细胞治疗等领域展示出了巨大的潜力。
为了确保其在临床应用和科研中的质量和安全，制定了一系列的质量检定标准。
下面将介绍的相关内容。
1. 细胞来源和提取。
细胞来源鉴定。
确保细胞来源的准确性和可追溯性，包括供体的信息、采集过程的规范性等。
提取和分离方法。
人脂肪干细胞的提取和鉴定吴尉;梁芳;宋小琴;胡平安;刘敏【摘要】BACKGROUND:Adipose-derived stem cel s are totipotent stem cel s in the adipose tissue, and have the function of self-renewal and multi-directional differentiation. Human adipose-derived stem cel s are ideal seed cel s with stable genetic milieu and few rejections. <br> OBJECTIVE:To extract human adipose-derived stem cel s from human omental adipose tissue and to identify the cel s by adipogenic and osteogenic induction. <br> METHODS:Omental adipose tissues were col ected from surgical patients to isolate and culture adipose-derived stem cel s using type I col agenase digestion, filtration and centrifugation. Cel growth was observed and proliferative curve of human adipose-derived stem cel s were drawn by cel counting method to calculate the doubling time at logarithmic growth phase. After adipogenic and osteogenic induction, induced cel s were identified using oil red O and alizarin red staining, respectively. <br> RESULTS AND CONCLUSION:Human adipose-derived stem cel s were successful y isolated from the omentum tissues of surgical patients. Adherent cel s were fusiform-shaped and like fibroblasts. The growth curve of passage 3 cel s was in S shape, and the doubling time was 45.90 hours. After adipogenic and osteogenic induction for 2 and 3 hours, respectively, oil red O staining showed unequal-sized orange fat droplets, and alizarin red staining showed typical calcified nodules that were in orange. These findings indicate that adipose-derived stemcel s have the adipogenic and osteogenic capacity.%背景：脂肪干细胞是存在于脂肪中的全能干细胞，具备自我更新能力与多向分化潜能，遗传背景相当稳定，体内植入后免疫排斥少，是一种比较理想的种子细胞。
人脂肪干细胞的培养及鉴定尚志刚;郭琼;李甜;白生宾;钟近洁;秦纹;冯树梅【摘要】Objective To establish an effective method on isolating and identifying Human adipose stem cells(hADSCs). Methods Collagenase digestion was adopted to isolate stem cells from human adipose tissue.These isolated cells were subcultured and passaged in vitro,the morphology and cell growth curve were characterized subsequently.Moreover,flow cytometry and multi-lineage differentia⁃tion ability were identified. Results The obtained cells with spindle-shape were adherent monolayer cells,and were arranged in whirlpool or radiation.The cell growth curve was a typical“S”shape ,indi⁃cating a 26h of doubling generation time.These cells are positive for CD29,CD105,CD44,negative for CD45 showed by Flow cytometry.The positive results of oil red and alizarin red staining also indicated that the obtained cells were pluripotent. Conclusion HADSCs could be obtained from human abode⁃men adipose tissue through a series of isolation and identified methods.%目的：探讨人脂肪干细胞的分离、培养并鉴定。
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。
Zuk等[1]从吸脂术抽取的脂肪组织悬液中最先分离培养出多向分化潜能的干细胞。
研究发现，ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。
人ADSCs主要来源于吸脂术得到的脂肪组织，随着整形美容业的迅猛发展，重睑手术所得的眶隔脂肪组织也随之增多，给ADSCs的取材提供了新的路径。
本研究主要探讨人上睑眶隔脂肪来源的脂肪提取ADSCs的可行性。
1材料与方法1.1脂肪组织来源本研究所用脂肪组织来自于潍坊医学院整形外科医院重睑手术者，均为女性，年龄18~30岁。
1.2主要试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Gibco公司，美国），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Hyclone公司）等。
1.3ADSCs的分离培养及传代将取出的脂肪组织放于无菌盘中，用PBS冲洗3遍，然后用无菌眼科剪刀剔除血管、筋膜等组织，再用PBS冲洗3遍。
把修剪好的脂肪组织放入盛有高糖DMEM（无血清）的无菌培养皿中，用眼科剪刀将脂肪剪成糊状，置于离心管中。
室温下离心（1200r/min）10min。
离心后可见离心管中液体分层：上层为白色泡沫，中层为清液，下层为黄色脂肪。
吸取上、中层丢弃。
加入3~5倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶和胰酶混合液（1∶1），将沉积于离心管底部的脂肪组织振荡打散，拧紧离心管后，用封口膜包裹，放入37℃恒温摇床中振荡（190r/min）消化30min。
将离心管自摇床中取出，肉眼观察可见无明显脂肪颗粒、白色泡沫贴壁，将液体用200目筛网过滤，滤液离心（1200r/ min）10min。
弃上清液，用PBS冲洗3遍，加入含有10％FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打成细胞悬液，用细胞计数板计数，调整细胞密度1.0×105mL-1接种于培养瓶中，在5%CO2、37℃标准环境下培养。
王岩斐自从美国加州大学洛杉矶分校（University of California, Los Angeles, UCLA）的研究人员在《细胞分子生物学》（Molecular Biology of the Cell）杂志介绍了这种新型成体干细胞群以后，脂肪干细胞（the adipose-derived stem cells, ADSCs）逐渐成为普遍应用于干细胞领域中的最受欢迎的干细胞群[1]。
由于其自身存在的多向分化潜能，和获取ADSCs的简单实用性，ADSCs将成为多能胚胎干细胞（pluripotent ES cells）的替代物，无论是在实验室仍是在临床应用中。
长期以来，对于各类原发的和继发的软组织缺损的医治一直是困扰整形外科医生的难题之一。
引发软组织缺损的原因有严重烧伤、感染、体表肿瘤切除术后、各类外伤和先本性疾病等[2]。
自体脂肪作为一种软组织填充物，由于其诸多的并发症曾一度被人们放弃，但随着组织工程技术及细胞生物学的发展，自体脂肪移植又逐渐被人们认可。
现将脂肪干细胞在脂肪移植中的作用及其临床应用现状综述如下。
1 脂肪移植的发展概况20世纪初，自体脂肪颗粒作为一种软组织填充材料开始应用于临床。
但是，由于其吸收率高、存活率低，且并发症较多，限制了其在临床中的普遍应用[3]。
21世纪初，通过改良脂肪获取技术，加速了脂肪血管化，提高了脂肪颗粒移植的成活率。
可是，坏死、吸收仍然是颗粒脂肪移植的主要并发症。
直到Zuk等[1]第一次从自体脂肪组织中分离取得具有多向分化潜能的细胞——ADSCs，脂肪移植的研究愈来愈深切，原因就是ADSCs来源丰硕，取材方便，且组织中干细胞含量丰硕（ADSCs在皮下白色脂肪组织中约占细胞总量的10%-20%[4]），不会引发伦理学争议等。
最近几年来，随着组织工程技术的迅速发展，为克服常规注射颗粒脂肪移植的问题，如吸收、囊肿、硬结等，Yoshimura等[5]又发明了细胞辅助的脂肪移植术（cell-assisted lipotransfer, CAL），该技术是将ADSCs与脂肪细胞混合，联合注射移植。
人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化引言干细胞是一类具有自我更新和多能性的细胞，可以不断分化生成各种不同类型的细胞。
人体脂肪组织中存在一种特殊类型的干细胞，即人体脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）。
与其他干细胞相比，hADSCs具有较高的抽取和培养效率，而且可以从自身脂肪组织中获得，不需要侵入性手术。
因此，hADSCs成为研究人体再生医学和组织工程领域的热门课题之一。
本文将介绍人体脂肪干细胞的培养方法以及成骨诱导分化的研究进展。
人体脂肪干细胞培养1. 来源和提取人体脂肪组织富含脂肪干细胞，因此从脂肪组织中提取hADSCs是最常用的方式之一。
提取过程通常通过脂肪抽吸或手术操作完成。
在脂肪抽吸中，通过低压吸引脂肪组织，并用特殊工具将其收集。
手术操作则需要进行小切口，直接收集脂肪组织。
提取得到的脂肪组织需要经过一系列处理，如洗涤、消化、离心等，以获得单个细胞悬浮液。
2. 培养条件提取得到的hADSCs需要在适宜的培养条件下进行扩增。
通常，使用营养丰富的培养基，如DMEM/F12，加入适量的胎牛血清和抗生素，以提供必需的生长因子和营养物质。
细胞培养的环境需要保持在37℃，5% CO2的恒温恒湿条件下。
培养过程中，需要定期更换培养基以保持细胞的生长和代谢活性。
3. 鉴定和鉴定为了确认提取得到的细胞为hADSCs，需要进行鉴定和鉴定。
常用的方法包括油红O染色、免疫细胞化学染色和流式细胞术分析。
油红O染色可用于检测细胞中脂滴的积累情况，免疫细胞化学染色可检测特定表面标记物的表达水平，流式细胞术则可对细胞表型进行全面的分析。
人体脂肪干细胞成骨诱导分化人体脂肪干细胞具有向多个细胞系分化的潜力，其中包括成骨细胞。
为了将hADSCs诱导分化为成骨细胞，需要在体外提供特定的诱导因子。
1. 前处理在进行成骨诱导前，需要对hADSCs进行适当的前处理。
小鼠脂肪干细胞提取方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：随着干细胞研究领域的不断深入，小鼠脂肪干细胞作为一种重要的干细胞资源备受关注。
小鼠脂肪干细胞具有较高的分化潜能和增殖能力，可广泛应用于再生医学、组织工程和疾病治疗等领域。
提取小鼠脂肪干细胞是进行相关研究的基础和关键步骤，因此本文将详细介绍小鼠脂肪干细胞的提取方法及其在研究中的应用。
通过深入探讨小鼠脂肪干细胞的重要性和相关提取方法，旨在为读者提供实用的研究参考和启发，促进小鼠脂肪干细胞研究领域的进一步发展。
1.2 文章结构本文主要分为引言、正文和结论三部分。
在引言部分，将介绍小鼠脂肪干细胞的重要性，并简要阐述文章的结构和目的。
正文部分将详细介绍小鼠脂肪干细胞提取方法，包括提取的步骤、操作注意事项和实验流程。
同时还会探讨小鼠脂肪干细胞在研究中的应用，如在生物医学研究中的作用和潜在应用价值。
在结论部分，将对提取方法的重要性进行总结，并展望小鼠脂肪干细胞研究的未来发展趋势。
最后，对整篇文章进行总结，强调小鼠脂肪干细胞研究的重要性和潜在价值。
1.3 目的小鼠脂肪干细胞作为一种重要的细胞资源，在干细胞研究领域具有广泛的应用价值。
本文旨在探讨小鼠脂肪干细胞的提取方法，为相关研究人员提供可操作的实验指导，推动小鼠脂肪干细胞研究的进展。
同时，通过总结现有提取方法的优缺点，展望未来小鼠脂肪干细胞研究的发展方向，为更深入的研究提供理论基础和实践指导。
通过本文的阐述和分析，旨在促进小鼠脂肪干细胞领域的持续发展，推动干细胞研究的进步。
2.正文2.1 小鼠脂肪干细胞的重要性:小鼠脂肪干细胞是一种来源于小鼠脂肪组织的多能干细胞，具有很高的潜在应用价值。
首先，小鼠脂肪干细胞具有自我更新和多向分化的能力，可以分化成多种细胞类型，如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，这使得它们在再生医学领域具有重要意义。
其次，小鼠脂肪干细胞来源广泛，并且易于提取和培养，这为研究人员提供了便利。
红色的是参考同类实验所用的方法，比例，不知道在我们实验室可行不，黄色是疑问的地方，希望老师解答下谢谢
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定
1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，
0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM 重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：
2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠
2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM
2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗
3、细胞培养的方法与步骤：
3.1无菌操作的要领和要求。
（前两周重点学习）
3.2细胞原代培养：
3.2.1操作步骤
a．培养用品消毒后，安防在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶, PH），用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于37℃水浴或恒温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。
30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。
d. 离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min？10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min？离心10分钟（先后顺序），得到单个核细胞。
加入培养液吹打混匀后取样计数。
根据计数结果调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。
e．接种培养：每10cm2的培养瓶接种1ml的细胞悬液，再添加4ml的培养液，盖紧瓶塞。
标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37℃5%CO2孵箱培养。
3.2.2 观察
每天对接种培养的细胞做常规性检查。
观察的主要内容：污染与否、细胞生长状态和pH（培养液颜色变化）等情况。
如发现培养液变为柠檬黄色有浑浊，表明已被污染，细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。
如培养液颜色变为紫色，可能系培养瓶有裂口或瓶塞漏气，CO2逸出或由于细胞生长不良有大量死亡。
如培养液为橘红色，一般说明细胞生长状态良好。
在没有发生污染，接种24h后，可见到许多细胞贴壁（由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状），24小时后第一次换液，以后3天换液一次（细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，变色时是否即可换液？）。
培养3-4天时，细胞生长繁殖，细胞数量增加，并可见细胞形成孤立小片（细胞岛），逐渐扩展，细胞透明，颗粒啥，界线清晰。
7-10天细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，（80%融合后）可进行传代培养。
3.3细胞传代培养
3.3.1操作步骤
a．取一瓶脂肪干细胞在倒置相差显微镜下观察，培养细胞如长成致密的单层，即可进行传代。
b．将培养瓶带人超净工作台，倒去细胞培养液，吸取2ml-3ml PBS加入培养瓶中，轻轻振荡后倾去，可重复进行一次。
c．加入5-8滴0.25% Trypsin,0.02%EDTA，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，置于室温下笑话2-3min。
翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜上出现针孔大小空隙时即可倒去消化液。
如见消化程度不够时可再延长消化
1-2min。
如见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能倒去消化液而直接进行下一步操作。
d．加入3ml培养液于培养瓶中终止消化。
吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，直至瓶壁上的细胞全被冲下，再轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。
取样计数，调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。
吸取1ml细胞悬液加到另一培养瓶中，原瓶留下1ml细胞悬液，弃去多余悬液（可分别提取1ml接种分配到多个培养瓶中？），并向每瓶中加4ml培养液。
盖好瓶盖，标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37℃5%CO2孵箱培养。
3.3.2观察
细胞传代后，每天对细胞进行观察，注意污染与否、细胞贴壁和生长状态等情况消化传代。
此过程中所做处理同原代培养。
注意观察细胞五个时期的特点（游离期、吸附期、繁殖期、维持期、衰退期）。
细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，这时可进行再次传代培养。
3.4 再次传代同上
4细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定
4.1在细胞镜下作形态学观察，与正常形态比较（原代培养后，传代2-3次，ACSs 呈现单层，大而扁的细胞形态，其直径在25-30um，待细胞达到汇合时，它们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞）
4.2细胞周期分析。
